酵母双通道光遗传学：多色光独立控制细胞过程与代谢途径

📅 2026-08-12 📰 Nat Commun 2026 May 22 📂 研究进展 👁 18

来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space

导读

光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理研究、生物材料和代谢工程中展现价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但因所需基因数量多及不同颜色光之间的交叉激活问题，多波长光遗传学一直未能在其中实现。本研究开发了一种仅需单基因、无需外源辅因子的紧凑型红光响应光遗传系统，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，最终与EL222蓝光系统整合，在酵母中建立了双通道光遗传学平台，实现了黄酮木犀草素合成的光控及细胞絮凝，还展示了双色活体材料图案化打印的潜力。

研究背景

光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比化学方法控制细胞功能，光具有避免有害化学品、与生物系统正交、动态可控及空间分辨率等优势。随着从红光、蓝光、绿光到紫外光等多种波长光遗传系统的发展，一个独特优势是可将不同颜色光进行多重化，实现对细胞不同功能的独立正交控制。虽然多重光遗传已在模式生物大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑型正交光遗传系统及不同颜色间的交叉激活问题，酿酒酵母仅实现了单通道光遗传应用。酿酒酵母遗传背景清晰，已被广泛应用于化学品生产、药物合成、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品及临床治疗等多个合成生物学领域。开发适用于酿酒酵母的多色光遗传系统，将拓展其动态正交控制不同细胞过程的能力。

研究方法

双通道光遗传学在生物材料图案化中的应用

本研究所涉及的双通道光遗传学最终应用是利用光遗传学的空间分辨率。利用光模式在特定位置指定细胞中基因激活的能力，已广泛应用于生物材料、神经科学及微生物群落相互作用研究。展示光遗传空间特性的常用方法是将图像投影到带有光敏感启动子控制下有色或荧光基因产物的细胞菌苔上，从而将图像“打印”到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅通过单通道光遗传实现了单色图像。

为实现多色图像，从OY-β.mA1LINX构建了菌株OY-γ.RB（红-蓝）。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。

▲ Cells were deposited on YNB agar by evaporating a layer of cells suspended in water overnight. Plates were exposed to 5% red light for 24 h through a mask, followed by 100% blue light for 24 hours through a mask. a Genetic circuit for OY- γ.RB (Red-Blue). b Imprinting letters spelling ‘I SEE YOU’. c

OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投影到表面（补充图16）。图案被切割在黑色纸张中用作滤光片，选择性地用红光照射24小时，然后用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，不需要NIR光来消除串扰（补充图17）。使用这种方法，研究团队成功印刻了从字母到标志和精细图像的多种多色图案，展示了系统的高空间分辨率及其在开发复杂活体材料方面的潜力。

红光通道的系统构建

多种红光响应转录因子已开发用于酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞。然而，其缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子或额外基因用于体内辅因子的内源合成。考虑到双通道系统中包含过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能够利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发，是一种单组分的远红光转录因子，通过工程改造光敏IsPadC BphP蛋白获得。该蛋白由DNA结合结构域与进化后的光敏核心模块融合而成，形成同源二聚体以防止DNA结合结构域的二聚化。在红光（660 nm）照射下，PCM构象改变以允许DNA结合结构域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）诱导从激活态向失活态转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它利用内源产生的胆绿素IXa。研究团队推断其在酿酒酵母中同样适用，因为酿酒酵母表达天然的亚铁血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。

▲ a 双通道光遗传学将能够对用于生物生产的生物体代谢流进行多功能控制，并可用于更复杂的工艺和优化。b 光遗传学在活体材料工程中具有潜在应用，通过两个光通道，可以控制活体材料上多个基因的局部表达。c 描述我们y-iLight红光通道的机制。d 描述EL222蓝光通道的机制。

细菌中展示的iLight版本不能直接适用于酿酒酵母，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活结构域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不理想，因为它利用酿酒酵母Gal4 DNA结合结构域，无法与酿酒酵母生物学正交。为工程改造适用于酿酒酵母的系统，研究团队将哺乳动物iLight变体的Gal4 DNA结合结构域替换为LexA蛋白——LexA常用于酿酒酵母正交合成转录因子。由于细菌变体利用突变的LexA结构域，研究团队推断该蛋白构象与野生型LexA同样具有功能。由于原始SV40 NLS已融合到Gal4结构域的N端，SV40 NLS被重新附加到C端，产生了一个命名为y-iLight的合成酿酒酵母转录因子。Y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由CYC1核心启动子上游的8个串联lexO重复序列阵列组成。为评估不同核心启动子对系统的影响，又克隆了两个额外质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆在mCitrine荧光报告基因上游的低拷贝附加体质粒中，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。

▲ a Genetic circuit of the iLight protein adapted to S.cerevisiae as a red light optogenetic system. b Expression of mCitrine fluorescent reporter through y-iLight paired with a lexO array upstream of various core promoters in comparison to constitutive P ACT1 . BY474R cells were cultured at 30 °C in

光强度培养条件

所有3个转化体在光遗传光箱（Optobox，设备规格见补充注释15）上培养，红光强度分别为0%、2.5%、10%、25%、50%和100%。ACT1启动子是酿酒酵母研究和工业应用中常用的特征明确的启动子。为评估工程启动子是否能驱动足够水平的基因表达以满足实际应用，将其活性与PACT1进行比较。因此，用y-iLight启动子替换为组成型PACT1、上游为mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。

双通道系统的整合与优化

为减少蓝光与红光通道之间的串扰，研究团队对y-iLight进行了模块化工程改造。通过引入光诱导核输出序列和光敏感降解决定子，构建了多种y-iLight变体（图3c、3d）。这些变体包括y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY，分别在蓝光存在下通过不同的机制降低红光通道的活性。

▲ a Expression of mTurquoise by BY474B in response to red light compared to blue light and darkness. Strain was cultured at 30 °C in a shaking incubator while exposed to 25% red light, 25% blue light or darkness. Fluorescence was measured at 24 h and normalized to OD 600 . Values are an average of 3 b

黄酮类化合物合成应用

为验证双通道光遗传系统在代谢工程中的实用性，研究团队构建了OY-γ.LutB/R(D)菌株，通过菱形途径将柚皮素酶法转化为木犀草素（图5a）。F3'H基因置于红光通道控制下，FNSI基因置于蓝光通道控制下。菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于周期为120分钟的不同红光和蓝光加NIR光循环。24小时后，提取黄酮类化合物并用HPLC表征。同时进行RT-qPCR分析F3'H和FNSI的相对表达量，以UBC6管家基因作为参照。

▲ a 通过菱形途径将柚皮素酶促转化为木犀草素。b OY-γ.LutB/R(D)的基因回路。c OY-γ.LutB/R(D)在红光与蓝光加近红外光（NIR）不同循环下的类黄

数学模型构建

研究团队建立了一个数学模型，阐明从柚皮素产生木犀草素的两条途径的调控机制和反应动力学（图6b）。模型模拟了在不同蓝光加NIR光与红光比例循环下的黄酮浓度变化（图6a、6c），预测了12小时光照周期下的时间响应曲线（图6d），并将模型预测与实验数据进行了R²值比较（图6e）。

▲ a Simulated flavonoid concentrations when exposed to one cycle varying proportions of blue plus NIR(Near-Infrared) light followed by red light illumination ( n = 1). b A schematic diagram of the model elucidating the regulatory mechanisms and reaction kinetics of the two pathways for producing luteo

研究结果

红光通道在酿酒酵母中的功能验证

与黑暗条件相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度的红光后均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已成功改造为在酿酒酵母中无需任何额外辅因子即可工作。不同的核心启动子导致不同水平的报告基因表达。值得注意的是，PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600均未显示生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为存在于所有三种核心启动子中，很可能是y-iLight转录因子本身的特性所致。

蓝光通道的验证

EL222蓝光光遗传系统在P6CCL启动子下驱动mTurquoise荧光报告基因表达，与组成型PACT1进行比较。BY474B细胞在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于0%-100%蓝光强度以及30分钟100%蓝光与30分钟黑暗交替循环。荧光在24小时时测量并归一化至OD600。结果显示EL222系统在蓝光照射下有效驱动报告基因表达（图2d）。

红光与蓝光通道的特异性验证

BY474B菌株在25%红光、25%蓝光或黑暗条件下培养。荧光在24小时测量并归一化至OD600。结果显示，与蓝光或黑暗条件相比，红光未显著激活蓝光通道的报告基因表达（图3a）。黑暗与红光条件的结果使用双尾独立t检验进行成对比较。

NIR光对y-iLight的影响

BY474R在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于25%红光。初始暴露2小时后，细胞继续暴露于25%红光、50% NIR光或黑暗中3小时。每小时测量荧光并归一化至OD600。结果显示NIR光能够使y-iLight从激活态回到失活态（图3b）。

减少串扰的y-iLight变体

通过引入光诱导核输出序列和光敏感降解决定子，构建了y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY等变体。在25%红光、25%蓝光或25%蓝光加50% NIR或黑暗条件下培养，荧光在24小时测量并归一化至OD600。结果使用双尾独立t检验进行比较，NS = p > 0.1， = p < 0.1， = p < 0.05， = p < 0.01。深蓝色括号表示差异显著性；绿色括号表示串扰减少；红色括号表示蓝光抑制表达与红光激活表达的倍数差异（图3e）。统计检验的P值见表2。

不同光强度下的变体表达谱

y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY在0-100%红光强度下培养，荧光在24小时测量并归一化至OD600。结果显示不同变体在不同光强度下表现出不同的表达谱（图3f）。

双通道同时激活的验证

OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY菌株在增加强度的蓝光加NIR光条件下培养（50% NIR加0-100%蓝光），以及在0-100%红光条件下培养。荧光在24小时测量并归一化至OD600。结果显示蓝光通道（mTurquoise）和红光通道（mCitrine）的表达分别受对应光强度的调控（图4a-4d）。

为测试两个通道的同时激活，菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于60分钟循环的25%红光后接25%蓝光，或25%红光后接25%蓝光加50% NIR光，以及25%红光加25%蓝光同时照射和三种光同时照射。荧光在24小时测量并归一化至OD600。结果显示双通道系统能够同时独立控制两个报告基因的表达（图4e、4f）。

▲ a. 在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY中，mTurquoise的表达；b. 在相同菌株中mCitrine的表达，均随蓝光加近红外光强度增加而变化。菌株在30°C振荡培养箱中培养，暴露于50%近红外光及0-100%蓝光下。24小时时测量荧光，并归一化至OD600。数值为3次生物学重复的平均值。误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。c. 在OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY中mTurquoise的表达；d. 在相同菌株中mCitrine的表达，均随光照强度增加而变化。

木犀草素合成的光控

OY-γ.LutB/R(D)菌株在周期为120分钟的不同红光和蓝光加NIR光循环下培养，第一个数字表示暴露于蓝光加NIR光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。24小时后提取黄酮类化合物并用HPLC表征。结果显示不同光照循环比例显著影响木犀草素的产量（图5c）。

RT-qPCR结果显示，F3'H表达在红光条件下显著上调，而FNSI表达在蓝光加NIR条件下显著上调（图5d、5e）。ΔCt值与黑暗条件相比的差异绘制在图中。

在12小时25%蓝光加50% NIR光后接12小时25%红光的培养条件下，每6小时提取黄酮类化合物并用HPLC表征。结果显示木犀草素在红光阶段积累，而柚皮素在蓝光阶段消耗（图5f）。反向光照顺序（12小时红光后接12小时蓝光加NIR）则呈现相反的趋势（图5g）。

模型预测与实验数据的比较

数学模型模拟了不同光照循环下的黄酮浓度变化。模型预测与实验数据的R²值通过计算得出（图6e），柱状图上的点表示用于比较的实验数据。模型较好地预测了不同光照条件下的黄酮动态变化。

双色图案化打印

OY-γ.RB菌株在YNB琼脂上通过蒸发细胞水悬浮液过夜沉积。平板通过掩膜暴露于5%红光24小时，然后通过掩膜暴露于100%蓝光24小时。结果显示成功打印了多种多色图案，包括拼写“I SEE YOU”的字母（图7b）、NUS iGEM 2021标志PRYSM（图7c）以及电影《小行星城》中角色Augie Steenback的静止画面（图7d），展示了系统的高空间分辨率和开发复杂活体材料的潜力。

讨论与解读

红光系统的性能评估

研究团队成功为酿酒酵母改造了一个响应红光刺激的光遗传系统，仅需单个转录因子且不依赖任何外源添加的辅因子。这解决了酿酒酵母缺乏紧凑型单组分红光光遗传系统的问题，使得光遗传学在酿酒酵母中的多重化应用成为可能。相比之下，最近开发的酿酒酵母红光响应转录因子PhiReX需要表达四个不同基因，包括酿酒酵母非内源辅因子的生物合成基因。使用PhiReX 1.1可实现高达41倍诱导，水平接近天然启动子PADH1；PhiReX 1.0可实现约2倍PADH1强度，但仅11倍诱导。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然启动子PACT1相当。因此，y-iLight系统的动态范围介于PhiRex 1.0和1.1之间，同时与常用天然启动子水平相当。

蓝光串扰的意外发现与解决

一个阻碍双通道光遗传活性的意外相互作用是蓝光与红光通道之间存在串扰。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在其基态吸收可见光谱红光范围的光，但在蓝光存在下也可能发生一定程度的激活。研究团队通过模块化工程改造蛋白结构域，成功降低了蓝光对红光通道的交叉激活。

编译者解读

本研究的关键突破在于将红光光遗传系统压缩为单基因组件并利用内源辅因子，避免了多基因整合带来的代谢负担——这是光遗传系统从模式菌株走向实际应用时常被忽视的工程瓶颈。通过模块化蛋白结构域改造降低蓝光串扰的策略，体现了合成生物学中"正交性"理念的精细实践。双通道系统在木犀草素合成和絮凝中的验证，展示了光控代谢通量分配的实用价值；而双色活体图案打印则为生物材料提供了新的制造维度。值得关注的是，模型与实验的R²比较为光遗传系统的定量设计提供了方法学参考。未来若能将更多波长的光纳入多重化体系，将进一步提升动态控制的维度与精度。

参考来源

Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nat Commun. PMID: 42173879.

PMID: 42173879

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