蓝藻无标记基因组工程平台实现四天产蔗糖7.12 g/L

📅 2026-08-12 📰 Plant Biotechnol J 2026 Jun 15 📂 研究进展 👁 18

来源：Plant Biotechnol J | 编译：DNA Lab Space

光合蓝藻能将二氧化碳直接转化为化学品，但重复的基因组编辑始终卡在单交换同源重组这道坎上。日本学者曾断言蓝藻遗传操作"稳定但缓慢"，而这项研究直接把迭代编辑的轮数压缩到了三轮——最终工程菌株在4天内积累蔗糖7.12 g/L。关键不在于跑得更快，而在于换了一条路。

研究背景

单交换（single crossover）是细菌同源重组中的常见现象，广泛存在于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、氧化葡萄糖酸杆菌以及绝大多数蓝藻中。这种重组方式会将整个质粒整合进基因组，留下抗生素标记和重复序列，导致工程菌株遗传不稳定，也让多轮迭代编辑变得异常困难。

聚球藻Synechococcus elongatus UTEX 2973（简称Syn2973）因生长速度快、固碳效率高而备受关注，是CO₂固定与生物转化的理想底盘。然而，Syn2973天然缺乏感受态——其菌毛生物合成相关的pilMNOQ基因簇不完整，转化通常依赖大肠杆菌介导的接合转移。这意味着穿梭质粒是遗传操作的刚需，而单交换事件又让每一轮编辑都留下"疤痕"。

如何在不留下标记、不破坏基因组稳定性的前提下，实现多轮迭代编辑？本研究给出了三套解决方案。

研究方法

菌株与培养条件

野生型Syn2973及工程菌株均使用标准BG11培养基（pH 7.5）培养。液体培养置于光照摇床（HNYC‐202T，Honour，天津）中，37°C、200 rpm振荡，持续光照强度约500 μmol photons m⁻² s⁻¹。固体培养则在光照培养箱（SPX‐250B‐G，Boxun，上海）中37°C培养，光照强度约300 μmol photons m⁻² s⁻¹。

大肠杆菌在相同温度与振荡条件下避光培养。枯草芽孢杆菌培养条件与大肠杆菌类似。需钠弧菌培养条件也与大肠杆菌大体相当，但使用LB2培养基（标准LB培养基额外添加1.5% NaCl）。氧化葡萄糖酸杆菌在甘露醇培养基（5 g/L酵母提取物、3 g/L蛋白胨、50 mM甘露醇）中30°C、200 rpm培养。

转化过程中使用SMM培养基（2.0 g/L (NH₄)₂SO₄、14.0 g/L K₂HPO₄、6.0 g/L KH₂PO₄、0.2 g/L MgSO₄、1.0 g/L柠檬酸钠二水合物）、MM感受态培养基（每10 mL SMM培养基添加125 μL 40%葡萄糖、100 μL 2 mg/mL色氨酸溶液、60 μL 1 M MgSO₄、10 μL 20%酪蛋白氨基酸、5 μL 0.22%柠檬酸铁铵）及饥饿培养基（每10 mL SMM培养基添加125 μL 40%葡萄糖、60 μL 1 M MgSO₄）。

抗生素使用浓度如下：Syn2973为20 μg/mL卡那霉素、20 μg/mL氯霉素、50 μg/mL壮观霉素、50 μg/mL红霉素和/或50 μg/mL链霉素；大肠杆菌为100 μg/mL氨苄青霉素。

单交换现象的跨菌种验证

研究者向大肠杆菌BW25113、枯草芽孢杆菌168、需钠弧菌Vmax、氧化葡萄糖酸杆菌621h及Syn2973中分别导入携带单一同源臂和抗生素选择标记的非复制型质粒。所有菌种均成功获得转化子，并经PCR验证——单交换重组在细菌中的普遍性由此得到确认。

穿梭质粒的构建

研究聚焦Syn2973的两个内源质粒pANS和pANL，将其复制起点与大肠杆菌兼容的pBR322骨架组合，构建了四种穿梭质粒：pSES‐ori和pSEL‐ori（含完整报道复制区域），以及pSES和pSEL（去除BsmBI/BsaI限制性酶切位点以支持Golden Gate Assembly，同时删除非必需序列）。对照组包括pRSF‐ori（基于RSF1010广宿主复制子）和pNSI（pBR322衍生质粒，含单一同源臂以支持Syn2973中的单交换整合）。

三套无标记基因组工程平台

第一套平台T4CROSS采用两个质粒、四轮单交换实现稳定的基因组重组。第二套平台TRIPLEARM使用含三个同源臂的单质粒，通过三轮单交换完成编辑。第三套平台CRISPRARM则将CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑与同源重组相结合。

以CRISPRARM平台为概念验证，研究者对蔗糖生物合成途径进行了三步序贯工程改造。

研究结果

单交换的普遍性确认

非复制型质粒携带单一同源臂和抗生素标记，在五个代表性菌种中均成功整合进基因组，PCR验证全部阳性。这一结果直接证实了单交换重组在细菌中的广泛存在，也解释了为何多轮遗传操作常遭遇稳定性瓶颈。

穿梭质粒的功能验证

pSES‐ori等四种穿梭质粒均能在Syn2973中自主复制。去除限制性酶切位点的pSES和pSEL版本支持Golden Gate Assembly，为后续的多片段组装提供了便利。

三套平台的建立与比较

T4CROSS通过两个质粒、四轮单交换实现标记-free的基因组重组。TRIPLEARM将三个同源臂整合进单一质粒，三轮单交换即可完成编辑。CRISPRARM则借助CRISPR/Cpf1的精准切割能力，与同源重组协同工作，大幅提升了编辑效率和准确性。

蔗糖生物合成的三步工程

以CRISPRARM平台执行三步序贯编辑，最终工程菌株在4天内产生了7.12 g/L蔗糖。这一产量数据直接验证了该平台在迭代基因组工程中的实用价值。

▲ 本研究示意图。(A) 穿梭载体结构图。(B) 诱导前后反选择标记生长效应示意图。(C) “T4CROSS”方法的重组策略与实验流程。圈内数字表示四次单交换事件的顺序。(D) “TRIPLEARM”方法的重组策略与实验流程。圈内数字表示三次单交换事件的顺序。(E) “CRISPARM”方法的重组策略与实验流程。

▲ Construction and characterization of shuttle plasmids. (A) Schematic overview of single homologous recombination plasmid design for testing. (B) PCR verification of genomic single‐crossover homologous recombination. The left panel shows the PCR verification results using primers F1 and R1 from panel

▲ 阴性选择标记的鉴定与应用。(A) Syn2973转化体在连续五次传代中发生单交换和双交换重组的比例。(B–E)不同阴性选择系统对Syn2973生长的影响（有无诱导物）：(B) SacB系统（50 g L⁻¹蔗糖），(C) TetA系统（2.5 μM Ni²⁺），(D) SepT₂系统（2 mM茶碱），(E) RpsL₁₂系统（50 μg mL⁻¹链霉素）。(F) SepT₂和RpsL₁₂在质粒消除中的应用。柱状图显示无质粒与保留质粒菌落的比例。

讨论与展望

三套平台各有利弊。T4CROSS不依赖CRISPR系统，避免了潜在脱靶效应，但四轮单交换的操作周期较长。TRIPLEARM将同源臂压缩至单质粒，简化了操作流程，但对同源臂的设计要求更高。CRISPRARM整合了Cpf1的精准编辑能力，在三步工程中展现了最高效率——7.12 g/L的蔗糖产量便是最好的证明。

选择Cpf1而非Cas9，可能与其识别富含T的PAM序列有关，这在AT含量较高的蓝藻基因组中更具优势。原文摘要未详述各平台的具体编辑效率对比数据，但三步工程的成功本身已说明问题。

这项研究的价值不仅在于蔗糖产量本身，更在于它为光合蓝藻的迭代基因组工程提供了一套系统性的工具包。CO₂到蔗糖的转化路径已经打通，下一步或许是将这套平台扩展到其他高附加值化学品的生物合成。Syn2973的固碳潜力，才刚刚开始被挖掘。

参考来源

Li S, Sun T, Liu D, Zhang T, Chen L. Iterative Genome Engineering Platform Enables Efficient Sucrose Biosynthesis From CO₂ in Photosynthetic Synechococcus elongatus UTEX 2973. Plant Biotechnol J. PMID: 42298770.

PMID: 42298770

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