底盘选择与代谢微调协同实现植物体内高效甜菜素生产

📅 2026-08-12 📰 Plant Physiol 2026 Jul 2 📂 研究进展 👁 17

来源：Plant Physiol | 编译：DNA Lab Space

导读

甜菜素是酪氨酸来源的天然色素，因pH稳定性优异而成为合成染料的理想替代品。本研究在拟南芥、烟草和大豆三种底盘植物中稳定引入优化后的甜菜素生物合成途径，通过“推拉”策略（增强前体供应+强化下游通路）系统比较了不同物种的代谢耐受性与生产能力。结果显示，“推拉”组合策略在三种植物中均显著提升甜菜素产量，其中大豆表现出最强的代谢耐受性，为植物合成生物学底盘选择提供了重要参考。

研究背景

甜菜素色素是酪氨酸来源的次生代谢物，呈黄色或红色，在植物中仅由石竹目成员独特产生。除鲜艳色泽外，甜菜素还展现出抗癌、抗炎或抗糖尿病等潜在健康功效。由于在宽pH范围内具有高稳定性，甜菜素被广泛用作天然食品着色剂。截至2024年，全球食品染料市场已超过40亿美元，但主要由石油来源的合成染料主导。2025年1月，美国FDA禁止在食品和口服药物中使用合成染料Red No. 3，并于2025年4月宣布逐步淘汰包括Red No. 40在内的更多合成染料。尽管需求日益增长，天然甜菜素的价格仍远高于合成对应物，主要受限于甜菜等天然来源的产量不足。

大多数植物合成生物学研究以本氏烟草为主要代谢底盘，因其农杆菌快速浸润方法便捷，但其他植物物种的代谢潜力尚未充分开发。本研究在拟南芥、烟草和大豆三种不同植物底盘中稳定引入优化甜菜素生物合成途径，系统分析其代谢影响。

研究方法

载体构建与遗传元件

本研究设计了4种初始载体：空载体（EV）、通过过表达BvTyrAα增强酪氨酸生产的“push”载体、含3个甜菜素基因的“pull”载体、以及同时含BvTyrAα和3个甜菜素基因的“push/pull”载体。由于甜菜素途径的代谢瓶颈尚未明确，初始设计使用组成型启动子实现持续表达。

优化的“push + pull”构建体采用以下元件组合：BvTyrAα编码序列侧翼连接N端矮牵牛叶绿体转运肽（CTP）和C端YFP标签，由拟南芥捕光叶绿素-蛋白复合物II亚基B1启动子（PAtLHB1B1，AT2G34430）或拟南芥NADH脱氢酶泛醌1β亚复合物亚基弱组成型启动子（PCL1，AT1G76200）驱动表达，使用胭脂碱合成酶终止子（NosT）。为防止“push”构建体在原核生物中的边际表达，在BvTyrAα编码序列中插入了马铃薯ST-LS1基因的第二内含子序列（含框内提前终止密码子）。RUBYv2由番茄rubisco启动子（PSlRbcS2）和本氏烟草Actin3终止子（NbActT）表达。额外拷贝的BvDODA转录单元由拟南芥rubisco启动子（PAtRbcS3）和无内含子烟草延伸蛋白终止子（EU）与热激蛋白终止子（EU/HSPT）组合驱动，编码序列侧翼连接C端FLAG标签。为防止两个相同序列间可能发生的重组，额外BvDODA转录单元使用了与RUBY构建体中密码子优化的BvDODA序列不同的甜菜BvDODA DNA序列，编码相同的BvDODA蛋白。

将BvTyrAα置于两种不同启动子下表达以优化“push”效果：PAtLHB1B1启动子驱动BvTyrAα在新“pull”构建体的光合组织中高水平表达（“PAtLHB1B1-push”），弱组成型PCL1启动子驱动BvTyrAα表达（“PCL1-push”）。据此生成两种新的“push + pull”构建体（“PAtLHB1B1-push + pull”和“PCL1-push + pull”），分别表达BvTyrAα、RUBYv2和额外BvDODA。

农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达

将新构建的载体在本氏烟草叶片中进行农杆菌介导的瞬时表达。在浸润后3天（dpi）采集浸润斑点，使用液相色谱-质谱联用（LC–MS）进行代谢物分析。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析，总甜菜素含量使用分光光度计在538 nm波长处测量吸光度。实验采用4个生物学重复。

烟草与大豆稳定转化

烟草和大豆用于稳定转化实验。从生根培养基移栽至土壤后6周，采集成熟叶片进行代谢物分析。大豆T0转基因系中，阴性对照为组织培养来源的非转化株系。

统计分析

数据经log10转换后进行单因素方差分析（1-way ANOVA），随后进行Tukey HSD检验（P < 0.05）。不同字母表示差异显著。箱线图使用BioRender生成。

研究结果

初始“push/pull”构建体未能产生稳定的烟草和大豆转基因系

为验证“推拉”策略是否能在异源植物宿主中增强甜菜素生产，生成了4种初始构建体。烟草和大豆最初用于稳定转化，因为甜菜素色素在组织培养早期阶段（如愈伤组织和芽再生，或 emerging 分生组织和早期芽）可被目视检测。EV、push和pull构建体均成功获得T0转基因烟草系，但push/pull构建体未能获得任何稳定转基因系。同样，在大豆中，EV、push和pull构建体均生成了多个稳定T0系，但未获得任何push/pull系。测序确认二元载体构建体内无重组或错误。鉴于在烟草和大豆中的一致失败，这些构建体未在拟南芥中测试。

为探究失败原因，将这些构建体在本氏烟草中瞬时表达。结果显示，“push/pull”构建体从L-DOPA到甜菜素的转化有限，导致L-DOPA过度积累。当RUBY“pull”构建体与“push”及额外拷贝的DODA基因共表达时，实现了最高的甜菜素产量。这些结果表明，“push”与“pull”工程之间的不平衡导致过量L-DOPA和/或其衍生物积累，可能干扰了稳定转基因系的成功生成。

▲ Optimized betalain construct with additional tyrosine supply boosts betalain production in N. benthamiana leaves. a) A simplified biosynthetic pathway of betalain pigments. Arogenate dehydrogenase from beet (BvTyrAα) shows relaxed feedback inhibition by tyrosine and was used to “push” the supply of

平衡push和pull的新甜菜素构建体实现优化生产

为进一步缓解DODA酶催化的瓶颈步骤，设计了新的RUBYv2构建体，重新排列甜菜素生物合成基因，将DODA置于另外两个甜菜素基因的上游（图1b）。该设计利用了多顺反子表达系统中第一个基因较高的翻译效率和表达水平。此外，新“pull”构建体中包含了一个额外的DODA转录单元。

新构建体的功能首先通过在本氏烟草叶片中瞬时表达进行测试。表达EV、PAtLHB1B1-push或PCL1-push构建体的叶片未见可见色素沉着。相反，表达pull、PAtLHB1B1-push + pull或PCL1-push + pull的叶片观察到强烈色素沉着（图1c）。浸润斑点于3 dpi采集并进行LC-MS代谢物分析。酪氨酸水平在PAtLHB1B1-push表达叶片中最高，PCL1-push次之，反映了两种启动子表达水平的差异（图1d）。push + pull表达叶片的酪氨酸水平略低于或显著低于其对应的仅push株系，表明酪氨酸被用于下游甜菜素生产。这些push + pull表达叶片中的L-DOPA水平远低于先前构建体表达水平。

▲ 推+拉构建部分缓解了T0烟草推系中观察到的生长抑制。a）稳定T0烟草植株表达推、拉或推+拉构建体，从生根培养基移栽至土壤6周后的表型。推构建使用P AtLHB1B1（强组成型）或P CL1（弱组成型）启动子。b）稳定烟草转基因T0系成熟叶中酪氨酸、L-多巴和甜菜红素水平的定量。移栽至土壤6周后收集叶盘进行代谢物分析。酪氨酸和L-多巴水平经分

Push + pull构建体部分缓解T0烟草push系的生长抑制

对稳定T0烟草植株的表型分析显示，表达push、pull或push + pull构建体的植株在移栽后6周呈现不同生长状态。PAtLHB1B1-push（强组成型启动子）和PCL1-push（弱组成型启动子）构建体均对植株生长产生不同程度的影响。代谢物定量分析采用生物学重复，样本量如下：EV（n = 4）、PCL1-push（n = 3）、PAtLHB1B1-push（n = 5）、pull（n = 32）、PCL1-push + pull（n = 34）和PAtLHB1B1-push + pull（n = 28）。成熟叶片的酪氨酸、L-DOPA和甜菜素水平经LC-MS和分光光度法（538 nm）测定。

▲ Soybean T 0 transgenic lines show higher tolerance to tyrosine and L- DOPA than transgenic tobacco lines. a) Phenotypes of stable T 0 soybean lines expressing push, pull, or push + pull constructs; Negative control, nontransformant line from tissue culture. b) Quantification of tyrosine, L- DOPA, an

大豆T0转基因系对酪氨酸和L-DOPA的耐受性高于烟草转基因系

大豆T0稳定转基因系表达push、pull或push + pull构建体后的表型分析显示，与烟草相比，大豆对工程途径表现出更强的耐受性。代谢物定量采用生物学重复，样本量如下：Wm82（n = 4）、PCL1-push（n = 15）、PAtLHB1B1-push（n = 14）、pull（n = 15）、PCL1-push + pull（n = 16）和PAtLHB1B1-push + pull（n = 22）。Wm82为Williams 82品种。

▲ 甜菜色素在烟草T1株系中可遗传。a）发芽后3个月，表达EV、pull或push+pull构建体的稳定T1烟草株系的表型。EV，空载体。b）来自EV、pull或P CL1-push+pull构建体的

甜菜素色素在烟草T1系中可遗传

对稳定T1烟草系的表型分析在发芽后3个月进行。表达EV、pull或push + pull构建体的T1烟草系呈现不同的色素沉着表型，花器官也表现出明显的颜色差异。成熟叶片的代谢物定量采用生物学重复，样本量如下：EV（n = 6）、2497-1-11（n = 12）、2497-2-12（n = 8）、2497-2-6（n = 12）、2524-2-5（n = 8）、2524-2-16（n = 3）、2524-3-2（n = 5）、2524-3-5（n = 9）、2521-2-4（n = 6）和2521-3-8（n = 11）。

▲ P CL1 -push + pull T 1 soybean seeds show elevated free and protein-bound tyrosine levels. a) Phenotypes of T 1 soybean seeds from EV, P CL1 -push + pull and P AtLHB1B1 -push + pull lines, shown with and without seed coats. b) Quantification of free tyrosine, L- DOPA, betacyanin, and phenylalanine l

PCL1-push + pull T1大豆种子中游离和蛋白结合酪氨酸水平升高

T1大豆种子表型分析显示，来自EV、PCL1-push + pull和PAtLHB1B1-push + pull株系的种子在有无种皮条件下呈现不同色素沉着。代谢物定量采用6个生物学重复。游离酪氨酸、L-DOPA、甜菜素和苯丙氨酸水平经LC-MS和分光光度法测定。蛋白结合氨基酸水平同样采用6个生物学重复进行定量分析。数据显示，PCL1-push + pull T1种子中游离和蛋白结合酪氨酸水平均显著升高。

▲ P AtLHB1B1-push + pull 株系的叶片表现出最强的甜菜色素沉积，并在 T1 代完成整个生命周期。a) 稳定 T1 代大豆株系（pull 或 push + pull 构建体）及野生型 Williams 82 (Wm82) 的表型。b) 大豆稳定转基因 T1 株系成熟叶片中酪氨酸、L-多巴和甜菜红素含量的定量分析。酪氨酸和 L-多巴水平通过 LC-MS 分析。总甜菜红素含量使用分光光度计在 538 nm absorbance 下测定。实验使用生物学重复进行，样本量如下。

PAtLHB1B1-push + pull株系叶片甜菜素色素沉着最强且完成整个生命周期

稳定T1大豆株系（pull或push + pull构建体）与野生型Williams 82（Wm82）的表型比较显示，PAtLHB1B1-push + pull株系叶片表现出最强的甜菜素色素沉着，同时能够完成整个生命周期。成熟叶片的代谢物定量采用生物学重复，样本量如下：EV（n = 5）、2693-17a（n = 9）、2693-7a（n = 5）、2689-21a（n = 2）、2691-16a（n = 5）、2691-2a（n = 6）、2691-5a（n = 5）和2691-7a（n = 5）。

▲ Cross-species comparison of betalain production reveals species- and/or promoter-dependent metabolic tolerance and life-cycle outcomes. Three distinct species (ie, Arabidopsis, tobacco, and soybean) were tested to stably express the optimized betalain pathway, combining an additional DODA and RUBY v

跨物种比较揭示物种和/或启动子依赖的代谢耐受性及生命周期结果

对拟南芥、烟草和大豆三种不同物种进行稳定表达优化甜菜素途径的比较研究。三种物种均测试了结合额外DODA和RUBYv2（“pull”）以及通过BvTyrAα增强酪氨酸前体供应（“push”）的策略，其中“push”分别由PAtLHB1B1或PCL1启动子驱动。结果显示，“push + pull”株系在三种物种中的甜菜素水平均高于“pull”株系，甚至超过甜菜根中的水平。强启动子驱动的拟南芥和烟草“push + pull”株系表现出矮化表型，而对应的大豆株系未出现严重生长缺陷，表明大豆对工程途径具有更强的耐受性。

讨论与解读

甜菜素是酪氨酸来源的色素，在植物中仅由石竹目成员独特产生，因其宽pH范围内的高稳定性而被视为天然食品着色剂。甜菜根作为商业甜菜素生产的主要来源，受季节性限制且成本高昂，因此需要建立可规模化且经济可行的天然色素生产平台。早期茄科植物稳定转基因工作产生的色素水平有限：茄子、马铃薯中为0.065至0.12 mg/g鲜重，番茄汁中最高达0.25 mg/mL。多顺反子RUBY系统简化了途径组装，将甜菜素生产扩展至胡萝卜（0.94 mg/g干重）和本氏烟草（约1.03 mg/g鲜重）。进一步推动前体供应和解除DODA步骤瓶颈后，本氏烟草甜菜素产量提升至2.87 mg/g鲜重，超过典型水平。

本研究通过精细的途径平衡设计——额外DODA拷贝与酪氨酸前体供应的协同增强——在三种植物底盘中实现了甜菜素的高效生产。大豆作为底盘的优势尤为突出：其对工程途径的代谢耐受性显著高于拟南芥和烟草，强启动子驱动下仍能维持正常生长。这提示底盘选择应综合考虑代谢容量、前体供应能力和对内源代谢干扰的缓冲能力。

编译者解读

本研究展示了合成生物学中“底盘选择”与“代谢微调”的协同重要性。通过“推拉”策略系统优化甜菜素途径，并在三种植物中平行验证，方法学上具有示范价值——尤其是发现大豆对工程途径的耐受性优于烟草和拟南芥，为后续选择高生物量、抗逆性强的作物底盘提供了数据支撑。局限在于：研究未深入解析大豆耐受性的分子机制，且T1代数据尚需多世代稳定性验证。从应用角度看，若大豆种子中甜菜素积累可稳定遗传并进一步提升，将为天然色素生产提供兼顾产量与成本的新平台。

参考来源

Jung S, de Oliveira MVV, Collier R, Yobi A, Angelovici R. Chassis selection and metabolic fine-tuning enable efficient in planta betalain production. Plant Physiol. PMID: 42261105.

PMID: 42261105

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