来源：细胞传代生长停滞消化时间驯化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
传代后48小时贴壁少，72小时还不长？别急着换血清。细胞传代生长停滞，大概率是消化时间没驯化、接种密度过低或胰酶残留，支原体和血清批次也会掺一脚。这篇按“先查低级错误、再分环节排查、最后看进阶疑难”走一遍，重点给你消化时间梯度、贴壁率验证和传代参数。照着做，能把原因缩到一两个。
第一步：快速排查低级错误
1. 胰酶没终止干净？0.25% Trypsin-EDTA消化后直接离心，残留胰酶会继续伤膜蛋白；用等体积含10% FBS完全培养基终止，300g离心5分钟，弃上清再重悬。
2. 传代比例太狠？T75长满按1:10传，密度低于2×10⁴/cm²恢复很慢；贴壁细胞按1:3-1:6传，接种密度2-5×10⁴/cm²。
3. 培养基或血清放太久？4°C开封超过4周、血清反复冻融，pH和生长因子会掉；换新配完全培养基，血清分装-20°C，37°C水浴不超过30分钟。
4. 消化时间照抄protocol？不同细胞系差很多；先做梯度：0.25%胰酶37°C 1、2、3分钟，镜下见细胞回缩变圆就终止，别等大片