来源：蛋白SEC色谱双峰聚集样品过滤处理（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑了一下午的 SEC，图谱上出现两个峰。先别急着怀疑柱子。双峰大概率不是仪器坏了，而是样品状态有问题。聚集、构象异构、柱过载、滤膜吸附，四个方向都可能产生“第二峰”。这篇教程按实验流程走一遍：从低级错误排查到过滤处理细节，再讨论两个进阶疑难情况。每一步都给具体参数和判断动作，照着做，能帮你把双峰缩回单峰，至少能知道它为什么在那里。
第一步：先排查低级错误，三分钟能排除一半
1. 样品没离心就直接上样。 直接看进样瓶底部；有絮状物就说明问题在这里。12000 g、4°C 离心 10 分钟，取上清，不要用枪头碰沉淀。
2. 缓冲液和滤膜没润洗。 0.22 µm 膜先用 5 mL 同种缓冲液过一遍再上样；缓冲液抽滤脱气 20 分钟，气泡也能造成假峰。
3. 上样体积超过柱床的 2%。 Superdex 200 Increase 10/300 柱床是 24 mL，上样不要超过 500 µL，超了峰变宽、拖尾、肩峰全来。
4. 柱子没平衡到位。 至少 2 个柱体积（48 mL）过完再进样，平衡不够时，盐峰和蛋白峰容易叠在一起。
第二步：分维度系统排查（按流程走）
1. 样品本身带聚集体
现象：主峰前面 8 分钟左右（V0 附近）冒一个尖峰，或者主峰左肩鼓包。
原理：可溶性聚集体分子量大，被排阻在孔外，先流出来。冻融一次，-80°C 拿出来 37°C 水浴快融，浓度高的样品最容易聚。
解决：把样品稀释到 1 mg/mL，4°C 静置 2 小时再离心，看峰还分不分。分装成 50 µL 小份，-80°C 只冻融一次。
验证：取双峰样品跑非还原 SDS-PAGE，聚集体那条带在还原胶上消失，基本就能确认。
2. 过滤和浓缩这一步做坏了
现象：过滤前一管，过滤后多出一个峰。
原理：0.22 µm 膜对小体积、高浓度蛋白是剪切力加吸附的双重打击；超滤浓缩到 10 mg/mL 以上，局部过饱和直接成核。
解决：换 0.45 µm 或 PES 低吸附膜，先用 5 mL 缓冲液润洗，弃掉前 3 滴滤液。超滤用 30 kDa MWCO，4000 g 离心、每次 5 分钟，不要连续离心 20 分钟。
验证：过滤前后各打一针，比对峰面积，聚集体比例涨了 5% 以上，就是过滤环节造成的。
3. 柱过载或流速过快
现象：双峰距离很近，主峰变胖，峰对称因子大于 1.5。
原理：样品量超过柱容量，分子间挤压，保留时间漂移，峰一宽就分裂成两个。
解决：上样量降到柱床体积的 1%（240 µL），流速从 1 mL/min 降到 0.5 mL/min。
验证：减半上样再跑一针，双峰并成一个，就是过载。
4. 缓冲液条件不对
现象：换个批次缓冲液，双峰出现。
原理：pH 靠近蛋白 pI（±0.5 以内），净电荷趋零，蛋白自己抱团。盐浓度低于 50 mM，非特异吸附也来了。
解决：pH 调到 pI 外 1 个单位，加 150 mM NaCl。含 His-tag 的样品，缓冲液里补 20 mM 咪唑压一压。
验证：同一批样品，两套缓冲液各跑一针，峰型立刻能比出来。
5. 二硫键介导的聚集
现象：聚集体峰占比 20% 以上，非还原胶上多出高分子量条带。
原理：游离巯基氧化交联，尤其在没有还原剂的缓冲液里，室温放置 2 小时就能看到变化。
解决：缓冲液里加 1 mM DTT 或 0.5 mM TCEP，现配现用，4°C 保存不超过 24 小时。
验证：加还原剂前后各跑一针，聚集体峰降下来，基本可以确认是二硫键。
第三步：进阶疑难，两种情况最麻烦
**1. 两个