qPCR扩增曲线异常引物二聚体优化

来源：qPCR扩增曲线异常引物二聚体优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space

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qPCR扩增曲线歪、Ct偏晚、NTC也起峰，十有八九撞上引物二聚体。别急着换酶、换模板，先看低级错误。本文按配液前处理、引物与体系、程序与荧光采集3步拆解，给你现象判断、具体参数和验证动作，SYBR Green和探针法的常见坑都覆盖，照着做能少走两轮无效实验。

第一步：快速排查低级错误

1. 封膜没压紧、板边蒸发：边缘孔Ct晚、曲线低，直接看板边孔。解决：用刮板把每个孔压透，1000×g离心1分钟，别省。

2. 配液气泡没消：曲线锯齿、荧光骤降。解决：离心后别剧烈晃，上机前目检。

3. NTC污染：NTC的Ct<35且熔解峰和样本一致，大概率是移液污染。解决：换枪头、分区配液，NTC最后加。

4. 引物稀释算错：1 OD加水量错10倍，500 nM终浓度能变5 µM。解决：先看管标签，重新稀释到10 µM母液，工作液200-300 nM。

先把这些低级错误过一遍，再往下走。

第二步别一上来就改程序。先按实验流程拆模块，判断二聚体到底从