多重PCR偏向性扩增引物平衡

来源：多重PCR偏向性扩增引物平衡（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space

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多重PCR最烦人的不是没条带，是条带一亮一暗。同样的引物，强靶标抢走酶和dNTP，弱靶标就掉队。本文按“先查手误—再拆流程—再攻疑难”的路径，讲透引物平衡：从浓度配比、退火温度、二级结构到模板与循环数，给出能直接照做的体积、温度和时间。别急着重新设计，先把现有体系救回来。

第一步：快速排查低级错误

先别怀疑设计。新手翻车，多半是手误。

• 引物工作液浓度记错。把100 µM母液当10 µM用，强引物直接翻10倍。解决：100 µM母液取10 µL加90 µL无核酸酶水，得10 µM，涡旋5 s。
• 模板加错或降解。弱条带组模板浓度只有强组的1/10。解决：测A260/280，1.8-2.0再用；cDNA统一稀释到10 ng/µL。
• 退火温度照抄单重。多重里强引物在55