来源：qPCR扩增效率低引物二聚体设计（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
qPCR翻车很常见。标准曲线斜率-4.2，NTC却起峰；样本Ct晚，熔解曲线70°C冒小峰。你以为是模板烂，其实可能是引物二聚体在抢资源。别急着换试剂。这篇把扩增效率低和引物二聚体设计放进同一条排查链，从加样、模板、引物、体系、程序到进阶疑难，给你能直接照做的参数和判断标准。
第一步：快速排查低级错误
1. 封膜不严或孔里有气泡：复孔Ct差超过0.5，先看膜。贴膜后用刮板压实，300×g离心1分钟，别用手甩。
2. cDNA没稀释或加样体积飘：原液cDNA直接加2 µL，抑制物容易拖低效率。统一稀释1:10，20 µL体系加2 µL，配大体积mix分装18 µL/孔。
3. 引物终浓度过高：终浓度超过0.5 µM，NTC更容易起峰。先降到0.2 µM each，二聚体严重时试0.1 µM。
4. 退火温度设低或程序选错：60°C退火却跑出70°C小峰，先做55-65°C梯度。SYBR程序要在60°C延伸末采集荧光，别选成终点法。
上面这四步花10分钟就能排掉。排完还低效，再往下看。
第二步：分维度系统排查
2.1 模板与cDNA质量
现象：标准曲线斜率-