来源：CRISPR编辑效率低sgRNA设计优化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
CRISPR做了三周，测序回来indel不到2%。细胞长得挺好，转染也亮。别急着换试剂盒。问题多半不在“手气”，而在sgRNA和验证链。这篇把编辑效率低拆成快速排错、分维度排查、进阶疑难三段。覆盖靶点选择、GC与polyT、二级结构、染色质、RNP递送、检测窗口和等位基因SNP。你照着动作链走，先定位，再改设计。
第一步：快速排查低级错误
1. sgRNA序列抄错或PAM位置错。 先核对。解决：回到基因组序列，确认20 nt靶序列紧邻NGG PAM，别把PAM算进sgRNA，也别漏5′端转录起始G；重新合成一条最便宜。
2. 用了T7体外转录sgRNA但没纯化或已降解。 跑胶先看。解决：2%琼脂糖看单一条带，浓度低于100 ng/µL就重做；更稳的是直接买化学合成sgRNA，用RNase-free水溶到100 µM，分装-80°C。
3. 转染/电转参数不对。 别照搬。解决：质粒转染用70-80%汇合，脂质体DNA 1 µg/24孔；RNP电转按1×10^5细胞用20 pmol Cas9+24 pmol sgRNA，电转后48-72 h再检测。
4. 检测窗口和编辑类型不匹配。 时间错了。解决：常规Cas9敲