来源：DNA酶切条带弥散甲基化敏感评估（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做HpaII/MspI甲基化敏感酶切，跑胶一看泳道里一坨弥散，很容易直接判成“甲基化”。别急。弥散可能来自DNA断裂、抑制剂残留、酶切不完全、上样过量，也可能只是电泳过热。下面按“快排低级错—分流程排查—疑难判定”走一遍，给你能直接复现的判定链。
第一步：快速排查低级错误
1. 模板是不是反复冻融、涡旋过？基因组DNA用宽口枪头轻弹混匀，1%琼脂糖胶看主带是否大于20 kb。解决：重新纯化，别涡旋。
2. 酶是不是加在管壁或忘了加？20 µL体系：DNA 500 ng、10×CutSmart 2 µL、HpaII 10 U、补水；加酶放末位，轻弹离心。解决：重配一管，酶最后加。
3. 缓冲液和酶匹配吗？HpaII、MspI都用CutSmart，别拿T4连接酶缓冲液凑。解决：换对应1×缓冲液，37°C 60 min。
4. 上样量是否超了？0.8%胶每孔500 ng以内，超过1 µg容易拖尾。解决：减到300–500 ng/孔，6×loading dye按1/6体积加。
第二步：分维度系统排查
1. 模板本身在断。 现象：未酶切对照也弥散，主带下移。原理：DNA反复冻融、涡旋或核酸酶污染会造成随机断裂。解决：0.8%胶检查完整度；A260/A280控制在1.8–2.0；RNA残留用RNase A 37°C处理15 min；必要时酚氯仿纯化。验证：未酶切孔应有一条大于20 kb的锐利主带，而不是拖尾。
2. 抑制剂把酶按住了。 现象：HpaII和MspI都不切，加酶与不加酶一个样。原理：SDS、EDTA、乙醇、盐、酚残留会抑制限制酶。解决：乙醇沉淀——加0.1体积3 M NaOAc和2.5体积无水乙醇，-20°C放30 min，4°C 12000g离心15 min，70%乙醇洗一次，溶于10 mM Tris pH 8.0；或过柱纯化。验证：纯化后重切，MspI孔应出现明显低分子量弥散。
3. 酶量、时间、甘油比例不对。 现象：部分弥散，高分子量底物还留一截。原理：酶不足切不动，