来源：杂交瘤融合效率低筛选（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
融合当天镜下细胞挺精神，过夜再看96孔板一片死寂；熬到第10天总算长出克隆，ELISA一测全阴性。两三个月白干，这种事太常见。问题多半不在运气，而在融合前的细胞状态、PEG手法和HAT筛选那几个节点。下面按流程拆开讲，从低级错误到进阶疑难，给你一条能照着走的排查路径。
第一步：先排除这4个新手高频错误
1. 骨髓瘤细胞没在8-AG里维持。Sp2/0传代图省事，耐药株被野生型挤掉，融合后全在HAT里死光。恢复加药传代，20 μg/mL 8-氮鸟嘌呤，融合前1周停药。
2. 融合时细胞不在对数期。长得太满或刚复苏就上，活率掉到85%以下基本白做。当天台盼蓝计数，活率必须>95%。
3. 脾细胞和骨髓瘤细胞比例颠倒。有人按1:1混，克隆出得少。常用5:1到10:1，脾细胞占大头。
4. 取脾时间不对。加强免疫后3天取脾最稳。早了B细胞没活化，晚了浆细胞已经在凋亡。
第二步：按流程分模块系统排查
模块一：融合前的细胞准备（占失败原因的六成）
1. 骨髓瘤细胞状态差
现象：融合后3-5天镜下全是碎片，偶见几个小克隆，传不下去。
原理：Sp2/0是HGPRT缺陷株，靠8-AG压着。长期不加药会回复突变，变成能在HAT里活的野生型，后面筛出来全是假阳性。
解决：每2-3周用20 μg/mL 8-AG筛一轮；传代别超过20代；融合前一周换正常完全培养基（10%-15% FBS）扩增。
验证：融合前取一小份细胞，单独接种HAT培养基，37°C、5% CO₂培养7天，应该全部死光。有活细胞就是耐药株污染了。
2. 细胞密度与活率不达标
现象：融合管底细胞团发灰，计数活率85%上下。
原理：PEG融合靠膜脂质重排，死细胞和碎片会稀释融合事件，还释放DNA让细胞黏成团。
解决：当天收Sp2/0，1000 rpm离心5分钟，无血清DMEM洗2次，活率>95%才往下走。脾细胞用200目网筛研磨，红细胞裂解液处理1-2分钟，别过头。
3. 饲养细胞层没铺或铺晚了
现象：孔里克隆稀稀拉拉，一个孔就1个克隆，没等到检测就老化变黄。
原理：低密度培养靠自分泌因子撑着，没有饲养层很难熬过HAT选择期。
解决：融合前1天铺饲养细胞，腹腔巨噬细胞1×10⁴/孔或胸腺细胞5×10⁴/孔，200 μL/孔，RPMI-1640+20% FBS。
模块二：PEG融合操作
4. PEG浓度和作用时间失控
现象：融合当天成团率挺高，过夜后大量死亡。
原理：50% PEG 1500/4000，pH 8.0-8.2。浓度偏高或作用超过2分钟，毒性直接杀细胞。
解决：37°C水浴，向细胞沉淀1分钟内匀速滴加1 mL 50% PEG，边加边轻摇，静置60-90秒，立刻终止。终止液按1 mL/30秒、2 mL/30秒、4 mL/30秒阶梯加，5分钟内加完10 mL，1000 rpm离心5分钟。
验证：做一次不加PEG的对照，细胞应该全部存活。对照也死，问题在细胞本身不在PEG。
5. 终止不彻底、吹打太猛
现象：细胞团打不散，铺板后成块沉底。
解决：终止后再用无血清DMEM洗1次，重悬用10 mL吸管轻吹，别用枪头反复抽吸。800-1000 rpm离心就够，转速越高碎片越多。
模块三：HAT筛选与铺板
6. HAT加药时机和浓度不对
现象：第3天一片碎片，第7天一个克隆都没有。
解决：融合后当天铺板，24小时后加HAT（次黄嘌呤100 μM、氨基蝶呤0.4 μM、胸腺嘧啶16 μM）。第2、4、6天各半换液一次，每次100 μL。第7-10天镜下数克隆，10⁷脾细胞一般出100-1000个克隆。低于50个，融合效率就是偏低。
7. 铺板密度过高，多克隆抢饭吃
现象：孔里克隆长得挺旺，上清ELISA永远阴性，阳性信号越传越弱。
原理：一个孔挤了5个以上克隆，强生长的非分泌克隆把养分抢光，阳性株还没扩起来就被压死。
解决：第10-14天阳性孔立刻有限稀释，0.5-1个细胞/孔铺96孔板，加饲养细胞，亚克隆做2-3轮。
第三步：进阶疑难问题
1. HAT耐药株污染，筛出来全是假阳性
现象：只加骨髓瘤细胞的HAT对照孔也长出克隆，还越传越旺。
判断：每批融合前必做这个对照，7天无活细胞才算合格。解决：从液氮重新取低代次细胞，20 μg/mL 8-AG驯化2周再用。已被污染的整批弃掉，别心疼。
2. 阳性克隆不稳定，传几代就丢
现象：第一轮ELISA强阳，冻存复苏后信号掉一半，两周后全阴。
原理：杂交瘤染色体丢失，轻链先丢，抗体