来源：蛋白纯化峰面积小上样缓冲液调整（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
纯化时最怕UV峰矮一截。上样量没变，峰面积却掉到原来一半，别急着换柱子。峰面积小常常不是仪器坏了，而是样品在上样缓冲液里没“活好”：pH偏了、盐高了、还原剂不够、去垢剂低于CMC，蛋白聚了或没挂柱。本文按样品处理、缓冲液配方、上样洗涤、洗脱检测四段拆排查，给你能直接照做的参数和验证方法，末尾补三个进阶坑。
第一步：快速排查低级错误
1. 上样前没离心或过滤：样品4°C、12000×g离心10 min，再用0.22 µm滤膜过滤，别让沉淀堵柱。
2. 缓冲液pH没校：用校准过的pH计调到目标±0.1；Tris在4°C会漂0.2-0.4，按纯化温度调。
3. 上样体积或浓度记错：核对A280和上样体积，峰面积应与上样蛋白量线性相关；先跑10 µL标准品确认。
4. 柱平衡不够：至少5-10 CV平衡，20 mM Tris pH7.4 + 150 mM NaCl，流速1 mL/min，UV基线平了再上样。
上面四条花10分钟就能排掉。别急着改梯度，先把“样品有没有进柱、柱子有没有平衡好”确认清楚。
第二步：分维度系统排查
模块A：样品制备与上样前处理
1. 样品有絮状物，峰面积小且柱压升高
现象：上样后流穿峰大，洗脱峰矮，柱压比平时高0.2-0.5 MPa。原理：聚集蛋白不能结合，还会堵柱。解决：上样缓冲液补到150 mM NaCl、5%甘油、1 mM DTT，4°C静置30 min，12000×g离心10 min；膜蛋白可加0.05% DDM。验证：上样前后A280、SDS-PAGE跑上清和沉淀。
2. 水稀释后峰更小，流穿峰变大
现象：一稀释就浑