来源：分子克隆菌落PCR假阴性模板制备（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你挑的菌落长得挺圆，PCR却空泳道？阳性对照有带，样品没有。别急着换酶、换引物。菌落PCR假阴性里，模板制备问题占一大半。本文按“挑菌—转移—裂解—加样—体系”全流程拆开讲，单菌落挑取、煮沸裂解、上清取样、抑制物控制、对照设置都覆盖，给出具体体积、温度、时间和验证动作。照着做，先把假阴性按下去。
第一步：快速排查低级错误
1. 枪头只蹭了琼脂，菌没进管。解决：用10 µL枪头轻触单菌落中心，直径1-2 mm，确认枪头尖有可见菌泥再放入20 µL无菌水。
2. 整个大菌落直接入25 µL PCR体系，琼脂和代谢物一起进去。解决：菌量控制为小米粒大小，模板上清不超过2 µL。
3. 煮沸后没离心，取到菌体碎片和培养基残渣。解决：95°C 10 min后12000 rpm离心2 min，取上清。
4. 忘了阳性对照，空泳道就慌。解决：每批加1 ng/µL纯质粒模板、空载体菌和水对照各一管。