来源：蛋白脱盐回收率低分子量截留（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
脱盐这一步，说穿了就是把咪唑、DTT、盐这些小分子换掉。可你辛辛苦苦纯化出来的蛋白，过完柱子一测浓度掉了70%；再跑个电泳，发现盐峰和目标峰还黏在一块儿。别急着怀疑柱子质量，八成是MWCO选错、转速超限或者死体积没回收。这篇把从选膜到回收的全链路拆开，每一步都给判断标准和具体参数，照着做，回收率能拉回80%以上。
第一步：先看这四个新手坑，30秒能排掉一半
1. MWCO贴着目标蛋白选。 目标蛋白25 kDa，你选了30 kDa膜——它不是被截住，是被"漏"走了。原则是MWCO取目标分子量的1/3~1/5，25 kDa就选5 kDa或10 kDa膜。
2. 离心力超了膜的耐受上限。 再生纤维素膜标称4000×g，你甩到12000×g。膜被压变形甚至穿孔，蛋白全进滤液。直接降到4000×g、4°C。
3. 膜没预洗就直接加样。 膜上的甘油和NaN3没洗掉，既污染样品又改变截留特性。用缓冲液预洗2次，每次300 μL，4000×g离心5分钟。
4. 脱盐柱上样体积超过柱床30%。 5 mL的G-25柱，你上2 mL样品。分离度直接崩，盐和目标峰重叠。
第二步：按流程分模块系统排查
模块一：样品本身的状态
1. 现象：样品发黏、离心半天滤液过不下去。
原理：高浓度蛋白（>10 mg/mL）在膜表面形成凝胶极化层，表观截留分子量反而下降，但局部剪切力升高会让蛋白变性吸附。
解决：上样前用缓冲液稀释到1-5 mg/mL再超滤；如果必须浓缩高浓度样品，分多次、短时离心。
验证：测滤液体积随时间的变化，若前2分钟出液正常、之后骤停，基本就是极化层。
2. 现象：回收率低，但滤液里也测不到蛋白。
原理：蛋白吸附在膜上。再生纤维素膜带负电，pI偏碱的蛋白（如pI 8.5在pH 7.4缓冲液里带正电）静电吸附严重。
解决：换PES膜或低吸附再生纤维素膜；缓冲液里加150 mM NaCl屏蔽电荷；或把缓冲液pH调到远离蛋白pI。
验证：用0.1% SDS或0.1 M NaOH洗膜后测洗脱液A280，能测出来就是吸附。
模块二：膜和柱子的选择
3. 现象：目标蛋白条带变淡，低分子量杂带出现在滤液里。
原理：MWCO是截留90%的球状蛋白的标称值，对非球状或糖基化蛋白实际截留率打折。
解决：留出安全余量，MWCO至少比目标蛋白小3倍。20 kDa选5 kDa，50 kDa选10 kDa。
验证：用已知分子量的Marker（如BSA 66 kDa、碳酸酐酶29 kDa）做一次空跑，看哪个进滤液。
4. 现象：脱盐后盐峰和目标峰分不开。
原理：G-25柱的外水体积约柱床的30%，上样超过这个值，小分子走外水、大分子走内孔的区别被冲垮。
解决：上样体积控制在柱床的25%以内。5 mL柱最多上1.2 mL；需要处理更大体积就串联两根柱或改用超滤换液。
验证：跑一次不含蛋白的盐样品，用电导率仪监测出峰位置。
模块三：操作执行
5. 现象：离心后膜上只剩一层干膜，加缓冲液也复溶不了。
原理：离心时间过长，样品被抽干，蛋白在膜表面脱水聚集。
解决：设定离心时间观察窗，一般500 μL样品、4000×g、4°C，10-15分钟足够；到点立刻取出，宁可多离一次也别离干。
验证：记录每次离心的出液体积，别超过滤杯刻度的80%。
6. 现象：换液后盐还在，或换液不彻底。
原理：单次稀释换液只稀释，不彻底去除。要做的是透滤（diafiltration）：浓缩→加缓冲液→再浓缩，重复3次以上。
解决：每次加回原体积的缓冲液，重复3-5次，小分子残留降到原来的1/100以下。
验证：测最终滤液的电导率，接近纯缓冲液值就算换干净。
第三步：进阶疑难
1. 低浓度样品（<0.1 mg/mL）回收率几乎为零。 这不是操作问题，是膜面积吸附的绝对损失。解决：先用0.1% Tween-20或0.05% Triton X-100封闭膜30分钟，或者干脆改用脱盐柱——柱层析的吸附损失小得多，只是会被稀释。另外可以在样品里加0.1 mg/mL BSA做载体，但下游要做质谱就别加。
2. 蛋白在膜上聚集成絮状沉淀。 常见于含咪唑洗脱液直接超滤。咪唑浓度高（>250 mM）时盐析效应强，加上局部浓缩，蛋白直接沉。解决：先透析或用脱盐柱把咪唑降到50 mM以下再超滤，或者换液时咪唑梯度递减。
3. 反复出现同一位置漏蛋白。 膜可能已经机械损伤。别省，换新管。同时检查离心机转子的水平/角转子适配器是否匹配，角转子会造成膜单侧受压。
避坑总结 + 实操建议
三条结论：
- MWCO永远比目标蛋白小3-5倍，别贴边选。
- 离心力看说明书上限，4°C、4000×g、10-15分钟，宁短勿长。
- 换液用透滤重复3-5次，不是加一次缓冲液就完事。
两个日常习惯：
- 每次超滤前预洗膜2次，用后立刻用0.1 M NaOH清洗并保存在20%乙醇里。
- 记录每批的滤液体积和目标蛋白回收率，建立自己的基线，异常一眼就看出来。
如果你的目标蛋白本身分子量很小（比如<10 kDa的多肽或小结构域），超滤几乎留不住，这时候可以考虑在N端加一个His-SUMO或GST标签把整体分子量撑到30 kDa以上再纯化，后续用酶切去掉。标签加在哪儿、酶切位点怎么排，可以在站内的引物设计工具