来源：基因编辑脱靶检测全基因组测序（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
CRISPR编完，全基因组测序跑完，打开变异列表一看——三千多个位点。哪些是真脱靶？哪些是建库、比对、背景突变凑出来的垃圾？别急着写结论。这篇教程按样本准备、建库测序、生信分析、结果验证四个环节，把WGS脱靶检测翻车的常见原因一条条拆开，给你能直接上手的判断标准和排查路径。
第一步：先排除这几个低级错误
1. gDNA降解或RNA污染。A260/A280低于1.7，或者跑胶看见200 bp涂抹带，后面什么分析都白搭。重新抽提，Qubit定量，0.8%琼脂糖胶确认主带大于20 kb。
2. 建库投入量不够。只投50 ng gDNA，文库复杂度低，重复率直接飙到40%。WGS建库至少投500 ng到1 μg，Covaris打断到350 bp主峰。
3. 忘了设对照。只测编辑样本，测出一堆变异说不清来源。必须配同源未编辑细胞或Cas9-only对照，同批次建库、同批次测序。
4. PCR循环数过高。扩增12个循环以上，duplicate rate爆炸，真脱靶信号被淹没。控制在6到8个循环。
第二步：分维度系统排查
模块一：样本与建库
1. 覆盖度不均匀，目标区域深度只有10×
现象：预测脱靶位点平均覆盖60×，但某些位点只有8到15×，变异检出置信度极低。
原理：GC含量极端区域（低于30%或高于65%）在建库和PCR时扩增效率差，加上重复序列竞争比对，导致深度塌陷。
解决步骤：用Picard CollectHsMetrics统计目标区覆盖；对GC偏差区域补做靶向捕获，把局部深度提到200×以上；建库时加入5%到10% PhiX平衡碱基多样性。
验证方法：重新统计覆盖均一性，目标区大于30×的比例应超过95%，平均深度100×以上。
2. duplicate rate超过30%，有效深度打折
现象：MarkDuplicates报告重复率35%，名义深度100×，实际只有65×。
原理：文库复杂度不足，PCR把同一条原始片段反复扩增，测出来的是同一个模板的拷贝，不是独立证据。
解决步骤：降低PCR循环到6到8；起始gDNA增加到1 μg；旧样本换新批次。必要时加dual index UMI标记。
验证方法：重复率降到15%以下，unique coverage才算达标。
3. 比对率低，reads有一半没贴上
现象：BWA-MEM比对率只有82%，大量reads落在多重比对区。
原理：测序质量差、接头残留，或者参考基因组版本不对——GRCh37和GRCh38混用是常见事故。
解决步骤：先跑FastQC和fastp去接头，Q30要求大于85%；确认参考基因组版本一致；把BWA-MEM换成BWA-MEM2或minimap2，加-K参数提高敏感度。
验证方法：比对率回到98%以上（人类），unique mapping rate超过90%。
模块二：变异检出与过滤
4. 假阳性爆表，几千个SNP但多数是背景
现象：GATK HaplotypeCaller输出3000多个变异，其中2000个在两个样本里都有。
原理：这些不是编辑产生的，是细胞系天然突变、测序错误和比对错误的叠加。不做对照减法，全都算到CRISPR头上。
解决步骤：用MuTect2或VarScan2做配对样本分析，只保留对照中不存在的变异；VAF阈值卡在5%到10%；过滤低复杂度区和segmental duplication区的calls。
验证方法：变异数应该降到几十到几百的量级；再用IGV手工看几个位点的比对情况。
5. indel漏检，明明有缺失却报不出来
现象：已知脱靶位点有2到5 bp缺失，标准流程没有报出。
原理：短读长比对时indel附近的reads容易soft-clip或被错配，HaplotypeCaller在低深度区灵敏度掉得快。
解决步骤：改用Delly或Manta做SV和indel检测；局部区域用CRISPResso2或amplicon深度测序确认；最小深度阈值下调到10×，但保留VAF不低于10%。
验证方法：对候选位点做Sanger或靶向amplicon测序，看实际indel比例。
模块三：结果验证
6. 找到的候选位点无法重复
现象：第一次WGS报了80个候选，第二次重做只剩20个重合。
原理：低VAF（低于5%）的变异受抽样波动影响大，加上细胞传代过程中克隆漂移。
解决步骤：同一批细胞做三个生物学重复，只保留至少两个重复都检出的位点；用GUIDE-seq或CIRCLE-seq做正交验证；锁定位点后做靶向深度测序，深度1000×以上。
验证方法：正交方法检出率超过70%的位点