来源：代谢流分析前处理淬灭控制（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做13C代谢流，最怕的不是质谱不出峰，是数据"看着正常、其实是错的"。淬灭没做好的样品，ATP掉一半，G6P漏到胞外，残留的12C葡萄糖把标记稀释掉，最后算出来的通量分布全是噪声。更麻烦的是，这些错误在质谱图上通常不报警。本文按采样前、淬灭瞬间、分离、洗涤、提取五个环节，把每一步"怎么判断→怎么验证→怎么解决"说清，参数全部给到能直接照做的数值。
第一步：先查这四个低级错误
1. 淬灭液没预冷到位。 从-20°C冰箱拿出来的60%甲醇，实测常常只有-12°C。解决：配好后放干冰-乙醇浴或-40°C循环槽，插温度计实测到-40°C±2°C再用。
2. 培养液和淬灭液比例不够。 1:2混完温度瞬间冲到0°C以上，代谢根本没停。解决：至少1:5，5 mL培养液配25 mL淬灭液。
3. 离心机设了4°C。 4°C对冷甲醇体系等于"室温"。解决：转头提前预冷30分钟，离心设-9°C到-20°C，4000–5000 g，3分钟。
4. 淬灭液用水或PBS配。 PBS的磷酸盐会污染LC-MS，还额外引入碳源。解决：超纯水配60%（v/v）甲醇，不要缓冲盐。
第二步：分维度系统排查
1. 采样管路死体积
现象：同一批菌，连续三次采样测出的G6P差20%以上。原理：从取样口到淬灭管之间的液体没接触到淬灭液，这段时间代谢照跑。瞬时13C标记实验要求淬灭在1–2秒内完成。解决：管路用内径0.5–0.8 mm的PTFE管，总长压到30 cm以内；采样前先弃掉1 mL冲洗死体积，或用三通阀切换。验证：在空淬灭管里预加13C-葡萄糖，正常采样后测下游代谢物有没有出现标记——出现就说明代谢在你的管路里继续跑了。
2. 淬灭温度与停留时间
现象：能量电荷（ATP+0.5ADP）/(ATP+ADP+AMP) 低于0.7，ATP/ADP小于2。原理：低温只是降速，不是停速。-20°C下糖酵解仍有约千分之一到百分之一的残余活性。解决：-40°C、60