来源：Gateway克隆效率低LR反应（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做过Gateway的人大概都遇到这种场面：BP反应顺顺利利，Entry clone测序全对，结果LR反应做完转化，平板上就长三五个克隆，还不一定是你要的。挑出来摇菌提完质粒一跑胶，发现是空载或者大小不对。时间全浪费在重新做反应上。这篇教程按操作顺序把LR效率低的坑挨个说清，从试剂加量到感受态细胞，每一步都给你判断方法、验证手段和具体参数。
第一步：先看这几个低级错误，一半的问题出在这里
1. Entry clone或Destination vector浓度是估的。 别拿Nanodrop的读数直接用，A260/280低于1.8说明有蛋白或酚残留，会抑制LR Clonase。跑个1%琼脂糖凝胶，跟Marker比亮度定量，再用TE buffer（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）稀释到100 ng/µL。
2. 摩尔比随手1:1加，其实差好几倍。 LR反应要的是Entry和Destination的摩尔数接近1:1，但两者质粒大小差很多时，等体积加就错了。按公式算：ng = (摩尔数 × 碱基数 × 650) / 10⁶。标准反应里Entry用50-100 ng，Destination用150 ng，按实际浓度换算体积。
3. LR Clonase反复冻融。 这个酶冻融三五次活性断崖式下跌。拿到手就分装成10 µL一管，-80°C存，用的时候冰上化，用完直接扔不再冻。
4. 反应体系里有高浓度盐或EDTA。 质粒如果是从含高盐洗脱液里来的，或者TE里EDTA加到了5 mM，Clonase直接罢工。质粒用无核酸酶水或TE pH 8.0稀释，EDTA别超过1 mM。
第二步：按反应流程分模块系统排查
1. 反应体系配制阶段
现象：所有样品一起失败，包括你以前做成功过的对照。
原理：LR Clonase是λ整合酶和整合宿主因子的混合物，对离子强度和pH敏感，最适pH 7.5-8.0。
解决步骤：
- 配20 µL体系：Entry 50-100 ng，Destination 150 ng，补TE pH 8.0到16 µL，加4 µL LR Clonase II，吹打混匀，别涡旋。
- 加酶前把体系先混好，最后加Clonase，加完轻弹管壁。
验证方法：同时设一个阳性对照——用试剂盒自带的pENTR和pDEST做平行反应，对照也失败就是酶或buffer的问题。
2. 孵育阶段
现象：阳性对照正常，你的样品克隆少。
原理：25°C是LR Clonase最适温度，30分钟到1小时是标准，但大片段或低丰度底物需要更久。
解决步骤：
- 常规反应：25°C孵育1小时。目的片段大于5 kb，或者Entry浓度低，直接过夜孵育，效率能翻几倍。
- 别用37°C，酶会失活；别放冰上，反应几乎不走。
- PCR仪设25°C保温，盖温设30°C防止冷凝。
验证方法：孵育结束后取2 µL跑胶看不到变化是正常的，LR产物和底物大小接近，只能靠转化验证。
3. Proteinase K处理
现象：转化后菌落数少，且背景克隆多。
原理：Clonase蛋白会结合DNA，不消化掉会降低转化效率，还会带来假阳性。
解决步骤：
- 反应完加1 µL Proteinase K（2 µg/µL），37°C孵育10分钟。
- 时间别超15分钟，太长会把DNA啃出缺口。
- 消化完可以直接转化，也可以-20°C存着第二天用。
验证方法：做过消化和没做过消化的各转化一次，菌落数应该差2-5倍。
4. 转化阶段
现象：蛋白消化的步骤没问题，平板还是稀稀拉拉。
原理：LR产物是环状质粒，靠热激进感受态，感受态效率直接决定结果。
解决步骤：
- 取2-5 µL反应液加到50 µL DH5α感受态里，冰上30分钟。
- 42°C热激45秒，立刻冰上2分钟。
- 加500 µL SOC，37°C复苏1小时。复苏时间别省，抗性基因表达需要时间。
- 涂100-200 µL到含相应抗生素的平板。Destination是卡那抗性（50 µg/mL），Entry常是氨苄（100 µg/mL），别搞混。
验证方法：用已知效率的pUC19转化同批感受态，效率低于10⁷ cfu/µg就换感受态。
5. 筛选与克隆鉴定
现象：平板长了一些克隆，但挑出来大部分是空的或者大小不对。
原理：LR反应中ccdB基因被置换掉，理论上只有重组成功的克隆能活。但ccdB会突变逃逸，长出来的小克隆往往是逃逸子。
解决步骤：
- 挑克隆时优先选中等偏大的，长得快的大克隆常是目的质粒。
- 挑4-8个克隆摇菌，用attB1/attB2通用引物做菌液PCR，或者提完质粒做酶切。
- 别只挑1个克隆测序，LR产物偶尔会有att位点重排导致小片段缺失。
验证方法：菌液PCR产物跑胶看大小，同时在LB里加卡那50 µg/mL，真重组子抗卡那。
第三步：进阶疑难情况
情况一：ccdB抗性逃逸克隆铺满平板。
背景全是小克隆，几百个，但都是空载。原因多为Destination vector保存太久或反复冻融，ccdB基因突变了。解决方案：重新划线纯化Destination，挑单克隆重新提DNA；或者换用ccdB死基因版本（ccdB survival）的载体。
情况二：大片段（>8 kb）重组效率极低。
长片段的att位点空间位阻大。做法是延长孵育到过夜，同时把Entry的摩尔比提到Destination的2倍，转化时全部20 µL反应液都涂板，别只涂一部分。
情况三：Multisite Gateway（三片段以上）几乎不长克隆。
多片段反应中中间载体的att位点方向容易错。检查每个Entry的att位点类型（attL1/L2、attL3/L4等），反应体系改成：各Entry各10 fmol，Destination 10 fmol，孵育过夜，转化后复苏延长到1.5小时。
避坑总结和日常习惯
三条核心结论：
1. 摩尔比算准，Entry和Destination按fmol配，别凭感觉加体积。
2. LR Clonase分装-80°C，绝不反复冻融，缓冲液EDTA控在1 mM以内。
3. 反应后一定做Proteinase K消化，37°C 10分钟，转化效率立刻改善。
两个日常好习惯：
- 每次做新批次反应，顺手加一个阳性对照，出了问题一眼能定位是酶的问题还是样品的问题。
- 菌液PCR筛克隆，挑4-8个再测序，省下测序费和时间。
相关工具
设计Entry克隆的attB引物时，用站内引物设计工具核对attB1和attB2的接头序列，别手抄错一个碱基，否则LR反应第一步就卡住。如果下游要做蛋白表达，可以顺手跑一下密码子优化工具，把目的基因换成大肠杆菌偏爱密码子；表达出来是包涵体的话，再用蛋白可溶性优化模块调一调标签和宿主，能少走不少弯路。