来源：蛋白表达诱导温度优化时机选择（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完 SDS-PAGE，诱导泳道和未诱导泳道一模一样——没条带、没变粗、没变淡。这时候多数人会去改 IPTG 浓度，或者干脆换个载体重做。别急，温度和时机才是重灾区。16°C 过夜看着温和，实际可能给你一堆降解片段；37°C 出菌体快，结果全是包涵体。这篇按“诱导前—诱导中—诱导后—验证”的顺序，把 OD 值、降温节奏、冷激处理、收菌窗口挨个排查一遍。
第一步：先看这4个低级错误
1. OD 测了没？ 直接拿过夜饱和菌液诱导是重灾区。OD600 冲到 2.0 再补 IPTG，质粒早丢了一半。重新接种，1:100 稀释，长到 OD600 0.4–0.6 再诱导。
2. 抗生素还在有效期吗？ 卡那 50 µg/mL、氨苄 100 µg/mL。氨苄母液 37°C 放两天就水解大半，配好分装 −20°C。菌液长得欢但什么都不表达，先怀疑这个。
3. IPTG 母液冻融几次了？ 1 M 母液过滤除菌后分装 −20°C，反复冻融浓度掉得厉害。终浓度从 0.1–0.5 mM 起步，别一上来就 1 mM 猛砸。
4. 装液量超了吗？ 250 mL 三角瓶最多装 50 mL。装到 100 mL，摇到 OD 0.6 时溶氧已经见底，诱导后长不动，也表达不动。
第二步：分维度系统排查
1. 诱导时机：OD600 0.4–0.6 是甜区，但不是死规定
现象：16°C 过夜诱导，条带很弱；或者摇 20 h 后 OD 才 1.5。
原理：OD 0.4–0.6 对应对数中期，核糖体数量足、质粒拷贝数稳、代谢冗余高。OD 低于 0.3，菌量不够，总蛋白基数就低；OD 超过 1.0，碳源耗尽、乙酸积累，表达机器开始衰退。
解决步骤：从甘油管划线，单菌落接 5 mL LB 过夜活化（不加 IPTG）；次日 1:100 转接 50 mL，37°C、220 rpm 长到 OD600 约 0.5；此时再降温或加 IPTG。目标蛋白毒性强的话，把门槛降到 0.3–0.4，减少质粒丢失和菌体裂解。
验证：诱导 0 h、2 h、4 h、过夜各取 1 mL，按 OD600 归一化后上样 10 µL。若 2 h 无条带、过夜才出现，说明起始菌量低或启动子弱，跟温度无关。
2. 温度切换的节奏：降温前先“缓冲”
现象：从 37°C 直接扔进 16°C 摇床，过夜后杂带一片，目标蛋白没几条