来源：单细胞测序cDNA扩增偏好校正（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完单细胞测序，聚类图上细胞全按 GC 含量分层，不按细胞类型分？同一亚群，3' 端基因表达普遍比 5' 端高一截？两块板做同一份样本，差异基因出来两千多个，大半是技术噪音。别急着怪测序深度。cDNA 扩增偏好是单细胞流程里最容易被忽视、又最难事后补救的一环。这篇按"先查低级错误、再按流程分模块、最后看进阶坑"的顺序，把怎么判断、怎么验证、怎么解决一次讲完。
第一步：先看这几个低级错误，它们能解释八成异常
1. PCR 循环数直接顶到说明书上限。 说明书写 12–18 个循环，你就跑 18 个。每多一个循环，偏好被放大一倍。低起始量样本先用 12 个循环跑一管，qPCR 测 Ct，落在 18–22 区间就够，不够再加 2 个。
2. TSO 用了普通修饰版本。 模板转换寡核苷酸不带 LNA 修饰，或者反复冻融超过 5 次，转换效率从 70% 掉到 30% 以下，cDNA 直接 5' 截断。用 1 µM 终浓度的 LNA-TSO，分装成 10 µL 小份，-80°C 存放，用一次扔一管。
3. 磁珠纯化比例写反。 0.8× 和 1.8× 的 AMPure XP 留下的片段分布完全不同。0.8× 丢掉小于 250 bp 的短片段，1.8× 连引物二聚体一起回收。看清楚当前步骤要的是哪个比例，再吸磁珠。
4. 忘加 ERCC spike-in。 没加外源对照，后面想定量校正都无从下手。每 1 µL 反应体系加 1 µL 稀释到 1:1,000,000 的 ERCC mix，混匀后再进逆转录。
第二步：按流程分模块系统排查
模块 A：逆转录与模板转换
现象：比对到基因 5' 端的 reads 比例低，基因 body 覆盖度从 5' 到 3' 呈明显斜坡；全长转录本检出率不到 40%。
原理：逆转录酶在 cDNA 3' 端加尾后，TSO 靠互补配对"模板转换"接上。这一步本身有序列偏好，尤其对高 GC 的 5' UTR 和二级结构强的区域，酶容易卡住或提前脱落。
解决步骤：
1. 逆转录温度从 42°C 调到 50°C。SSIII 或 Maxima H Minus 都耐受，高温能打开二级结构，5' 覆盖度通常能提 10–15 个百分点。
2. 逆转录时间从 60 分钟延到 90 分钟，但别超过 90 分钟。酶活性下降后反而增加非特异产物。
3. MnCl