来源：RNA电泳条带弥散甲醛变性胶（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑RNA甲醛变性胶，最怕的就是打开凝胶成像仪那一刻——28S和18S没分清楚，整条泳道糊成一片，像被人用手指抹过。目标问题除了"整体弥散""向上拖尾""两带合一"，还有泳道底部一坨亮斑。这篇教程按配胶、变性、上样、电泳四个环节，把12个常见原因逐条拆开，每条给你判断方法、验证动作和解决参数，照着做基本能定位。
第一步：先用两分钟排掉低级错误
新手翻车，八成不是高深问题。
1. 甲醛上次用完没换，瓶子开封超过一个月。 判断：闻一下有刺鼻酸味或溶液发黄。解决：直接换新开封的甲醛，别心疼。
2. 缓冲液用错，拿TAE或TBE跑了。 判断：回想配胶时瓶子颜色。解决：RNA变性胶只能用1×MOPS，pH 7.0，其他缓冲液会让甲醛失效。
3. 上样量太大，28S带整个糊掉。 判断：换1/5量重跑一次。解决：总RNA上样0.5-2 μg，别超过5 μg每孔。
4. 电泳槽没洗干净，手上残留RNase。 判断：换一个新洗的槽对比跑。解决：0.1% SDS洗+3% H₂O₂泡15分钟，再用DEPC水冲。
第二步：按流程分维度系统排查
A. 样品端（RNA本身好不好）
1. 现象：所有泳道都弥散，28S/18S比例低于1。
原理：RNA被RNase切成小片段，短片段跑得更快，形成从加样孔到前沿的连续拖尾。解决步骤：抽提时每1 mL Trizol加200 μL氯仿，振荡15秒、室温静置3分钟、12000 g 4°C离心15分钟；取水相时枪头别碰中间层。验证方法：取2 μL测A260/A280，比值低于1.8就要警惕；或直接跑一次不加甲醛的普通胶看是否也糊。
2. 现象：条带"发胖"、边缘虚、两带之间发灰。
原理：样品盐浓度过高，导电不均，局部电压骤升。解决步骤：乙醇沉淀后用75%乙醇洗两次，每次12000 g离心5分钟，晾干5分钟再溶于10 μL DEPC水。验证方法：测电导率，或者把样品稀释5倍重跑，弥散减轻说明就是盐的问题。
3. 现象：上样孔里还留着一大坨亮斑，底下才弥散。
原理：RNA没完全溶解，或者残留乙醇抑制了变性。解决步骤：65°C水浴10分钟助溶，涡旋5秒，短暂离心。验证方法：上样前取1 μL点样在紫外灯下看，应该清亮无颗粒。
B. 变性环节（甲醛有没有真正起作用）
4. 现象：28S和18S挤在一起，分不开。
原理：RNA二级结构没打开，仍保持折叠状态，迁移率不一致。解决步骤：RNA 1-2 μg加2×上样缓冲液（95%甲酰胺、0.025% SDS、0.025%溴酚蓝、0.5 mM EDTA），65°C变性15分钟，立即冰浴2分钟。验证方法：对比跑一次变性10分钟和15分钟，条带锐度会明显不同。
5. 现象：甲醛加进去后胶液发白、凝固不匀。
原理：琼脂糖溶液温度超过60°C时加甲醛，甲醛挥发且破坏凝胶网络。解决步骤：融胶后放55°C水浴降温到约55-60°C，再在通风柜里加甲醛至终浓度2.2 M（例如100 mL胶加27 mL 37%甲醛），轻摇混匀立刻倒胶。验证方法：凝固后胶应透明均一，无白斑。
6. 现象：所有样品都拖尾、且加样孔附近最强。
原理：甲醛本身失效或浓度不足。解决步骤：新配1×MOPS（0.2 M MOPS、0.05 M乙酸钠、0.01 M EDTA，pH 7.0），不要用NaOH调pH过度。验证方法：用已知完好的HeLa总RNA做阳性对照，同胶同槽跑。
C. 电泳条件（电压和缓冲液）
7. 现象：条带整体向下斜、拖尾方向跟电场一致。
原理：电压过高，胶发热，RNA部分降解。解决步骤：按5 V/cm（电极间距离）计算，例如两电极间隔20 cm就是100 V，跑2-3小时。验证方法：手摸电泳槽外壁，温而不烫才正常。
8. 现象：靠近加样孔处条带糊，远端清晰。
原理：MOPS缓冲液重复使用多次，离子强度失衡，pH漂移。解决步骤：每跑一次换新1×MOPS，至少每两次换一遍。验证方法：看溴酚蓝前沿是否走成一条直边，弯了就是缓冲液问题。
9. 现象：28S/18S正常但整体发虚、信号弱。
原理：胶太厚导致染色不均。解决步骤：胶厚控制在3-5 mm，凝固30分钟以上再拔梳子。验证方法：EB染15分钟后脱色10分钟再看。
第三步：进阶疑难
10. 现象：条带完整但每个泳道都出现"弥散光晕"，换了RNA也一样。
大概率是电泳槽和梳子的问题。梳子残留乙醇或DEPC处理不彻底，会局部降解RNA。处理：梳子泡3% H₂O₂ 30分钟，DEPC水冲两遍再晾干。
11. 现象：只有部分泳道弥散，且不固定。
这是典型的操作差异。检查是否在不同时间点加样、是否有个别样品冰浴太久。RNA在冰上放超过30分钟会部分降解，加完样立刻跑。
12. 现象：凝胶成像图上弥散，但肉眼在紫外灯下看并没那么糊。
是染色问题，不是电泳问题。EB浓度过高（>0.5 μg/mL）或SYBR Gold染太久都会产生荧光扩散。改用0.5 μg/mL EB染15分钟即可。
避坑总结和日常好习惯
三条核心结论：
1. 弥散九成是RNase或甲醛失效，先换甲醛和新缓冲液再谈别的。
2. 变性温度和时间不能省，65°C、15分钟、立刻冰浴，缺一不可。
3. 电压5 V/cm、缓冲液每两次换新，比任何高级试剂都管用。
两个日常习惯：
- 甲醛分装成1 mL小管、-20°C避光保存，用一管取一管，开封那瓶不放4°C超过两周。
- 电泳槽、制胶槽、梳子专用，每次用完0.1% SDS清洗，DEPC水冲，倒扣晾干。
跑胶是RNA质量的第一次体检。如果反复排查仍弥散，建议回到上游看抽提和下游的引物设计。设计qPCR引物时，跨内含子、长度80-200 bp、Tm 60°C左右，这些参数在站内的引物设计工具里可以直接算。如果接下来要做原核表达，密码子优化和蛋白可溶性优化工具也能帮你在跑胶之外省下几轮试错。