来源：层析柱柱压升高反压处理（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
柱压飙了？泵一停，样品可能毁，柱子可能废。你盯着ÄKTA屏幕，压力从0.3 MPa冲到0.5 MPa，报警灯闪。别急着拆柱。本文覆盖从低级错误到柱体污染，含反冲、清洗、重装的具体参数。照着做，大概率救回柱子。
第一步：快速排查低级错误
先查这4个新手坑。别浪费时间。
- 样品没离心过滤。直接 12000 g，4°C 离心10 min，上清过0.22 µm滤膜。
- 缓冲液没脱气。超声15 min，或开在线脱气。含0.1% Triton时更易起泡。
- 流速开太大。先把流速降到0.2-0.5 mL/min，看压力是否掉。
- 管路接错或柱头拧太紧。检查进出液口。柱头拧到不漏即可，别死拧。
第二步：分维度系统排查
按流程走：样品→缓冲液→系统流速→柱体。每个原因给你完整动作链。
1. 样品颗粒物或粘度太高
现象：上样瞬间压力陡升。换平衡液后仍高。
原理：细胞碎片、沉淀、DNA堵筛板。粘度增加背压。
解决：12000 g，4°C 离心10 min。0.22 µm过滤。加DNase I 10 U/mL，室温15 min。高盐样品稀释到电导<5 mS/cm。
验证：上样前后压力对比。过滤后压力应降0.05-0.1 MPa。
2. 缓冲液气泡或结晶
现象：压力脉冲波动。泵头有气泡声。
原理：气泡在柱床内压缩-膨胀，形成气阻。
解决：超声脱气15 min。在线脱气。0.22 µm过滤。20%乙醇冲洗系统。
验证：停泵排气，压力立即归零。重新跑水，压力稳定。
3. 流速过高或温度太低
现象：压力随流速线性升高。降流速就降。
原理：达西定律。背压与流速、粘度成正比。4°C水粘度是25°C的1.7倍。
解决：流速从1 mL/min降到0.2 mL/min。柱温升到25°C。换0.5 mm内径管路。
验证：画压力-流速曲线。线性说明正常。非线性说明堵。
4. 柱头筛板堵或填料污染
现象：反冲压力也高。峰形拖尾，柱效掉。
原理：筛板孔径0.5-10 µm，被颗粒堵。填料吸附杂蛋白、脂质。
解决：反冲0.2-0.5 mL/min，10-15 min。0.5 M NaOH 30 min。6 M盐酸胍 30 min。实在不行换筛板