来源：包涵体洗涤去膜碎片（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
开篇导语
收包涵体时，沉淀黄白粘稠，SDS-PAGE 上膜蛋白杂带一堆，目标蛋白却不见纯？大概率是膜碎片没洗掉。别急着上尿素溶解，先看裂解、去垢剂、盐、EDTA、离心条件。本文按实验流程拆成8步，从低级错误到进阶疑难，直接给判断、验证和解决参数，帮你把包涵体洗到更干净。
第一步：快速排查低级错误
1. 菌体没完全重悬就加裂解液。冰上按1 g湿菌加5-10 mL裂解缓冲液，枪头吹打加涡旋30 s，确保无块。
2. 裂解不彻底就离心。超声300 W，工作3 s间歇5 s，冰浴30-50次；或高压均质2-3次，镜检无完整菌再往下走。
3. 初离转速太低。包涵体初离用10,000-12,000×g，4°C，15-20 min；洗涤沉淀用15,000×g，20 min。
4. 洗涤液体积太少。1 g菌泥至少用20-30 mL洗涤液，粘度过高时膜碎片和包涵体分不开。
第二步：分维度系统排查
1. 裂解后粘度像鼻涕，包涵体沉不下来。
现象：离心上清挂壁，沉淀松，膜蛋白杂带多。
原理：DNA/RNA释放，膜碎片密度低，和包涵体共沉。
解决：加DNase I至5-10 µg/mL，MgCl2 2-5 mM，37°C 15 min；或补超声300 W，3 s/5 s，总5-10 min。
验证：上清和沉淀分别跑SDS-PAGE，看目标蛋白是否在沉淀；镜检无完整菌。
2. Triton X-100没洗掉膜，杂带还在。
现象：沉淀黄白粘稠，1% Triton X-100洗后膜蛋白仍多。
原理：Triton去膜需要足够体积和孵育，低温易分层不完全。
解决：1 g湿菌泥加20 mL洗涤液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，4°C翻转30 min，15,000×g 4°C 20 min，重复2次。
验证：第二次洗涤上清A280低；SDS-PAGE膜蛋白条带减弱。
3. 脱氧胆酸钠浓度过高，包涵体一起溶了。
现象：洗后沉淀变少，目标蛋白跑到上清。
原理：NaDOC比Triton强，>1%或37°C易溶部分包涵体。
解决：用0.5%-1% NaDOC，冰上10-15 min，15,000×g 20 min；目标蛋白丢失就降到0.2%-0.5%。
验证：上清和沉淀分别跑胶，看目标条带分布。
4. EDTA加错时机，膜碎片又回来。
现象：单独用EDTA洗，膜杂带没降。
原理：EDTA螯合Ca2+/Mg2+破坏膜整合，但需和去垢剂联用。
解决：裂解液加1-5 mM EDTA，洗涤液加1 mM EDTA；别和DNase同时高浓度EDTA，会抑制DNase。
验证：对比加和不加EDTA的洗涤后SDS-PAGE。
5. 尿素洗涤把膜和包涵体一起搞散。
现象：2 M尿素洗后沉淀少，杂带仍多。
原理：低浓度尿素剥弱结合蛋白，高浓度或室温会溶包涵体。
解决：0.5-2 M尿素，4°C 10-20 min，15,000×g 20 min；膜碎片多先用Triton/NaDOC，再上尿素。
验证：看上清蛋白量和目标蛋白回收率。
**6. 离心