来源：RNA提取降解弥散处理（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
提完RNA一跑胶，28S和18S糊成一片，下面还拖着长长的尾巴。这大概是分子实验室最让人心烦的画面。降解、基因组污染、盐残留，三种问题的胶图长得都像，新手很容易误判，一管样品说扔就扔。下面按取样、裂解、抽提、沉淀、洗脱、检测的完整流程走一遍，每一步告诉你现象长什么样、怎么判断、怎么救回来。绝大多数弥散，其实在第3步之前就注定结局了。
第一步：先别急着怀疑试剂盒，这四个坑占了八成
1. 电泳缓冲液用了三周没换。TAE反复回收，pH升到8.5以上，RNA在碱性条件下磷酸二酯键直接水解。换新配的1×TAE，或者改用1×MOPS甲醛变性胶跑。
2. 上样量太大。每孔上2 µg以上，28S条带饱和糊开，看着就像弥散。改成每孔200-500 ng，1.2%琼脂糖，5 V/cm跑20分钟。
3. 电压拉太高、跑太久。100 V跑30分钟，胶体发热，RNA当场降解。降到60-80 V，胶槽里丢个冰袋，或者干脆放4°C冷柜里跑。
4. 枪头、EP管、水不是无RNase的。手摸过的管壁、开封半年的DEPC水、共用枪头盒，全是RNase来源。直接换新拆封的耗材，水用新开的。
第二步：按流程分维度系统排查
1. 取样和保存没冻透
现象：同一批样本，有的完好有的全降解；或者组织块边缘完整、中心弥散。
原理：组织离体后内源RNase在几秒内启动，室温放30秒就够让mRNA开始断裂。液氮只冻表面，1 cm³以上的块中心降温慢得很。
解决：切取组织块控制在0.5 cm³以内，离体30秒内投液氮，研磨全程保持液氮不干。来不及处理就用RNAlater按1:10体积浸泡，4°C过夜后转-80°C。
验证：同一组织切两块，一块按上面做，一块室温放5分钟，Trizol提取后并排跑胶，28S/18S比例差异一眼就能看出来。
2. 研磨不充分，或者研磨时样品化了
现象：得率低，A260/280低于1.7，条带偏弱但没有明显弥散。
原理：磨不碎，裂解液进不去细胞，RNA根本提不出来；磨到一半样品融化，内源RNase复活，边提边降解。
解决：液氮研磨时研钵持续补液氮，磨成细粉再加Trizol，每50-100 mg组织配1 mL Trizol。植物或纤维组织磨完后再超声3×10秒。
验证：研磨后取1 µL镜下看，没有明显组织块再往下走。
3. 裂解不彻底、Trizol比例不对
现象：得率低，水相和有机相界面模糊，中间层特别厚。
原理：Trizol量不足，细胞裂解不完全，DNA和蛋白没被有效分开，RNA被裹在中间层里损失掉。
解决：贴壁细胞每10 cm²用1 mL Trizol，血液每100 µL用1 mL。加完Trizol室温静置5分钟再动。
验证：加氯仿前看裂解液是否清亮黏稠。浑浊就是裂解不到位，补加Trizol或者延长静置。
4. 氯仿分层和离心温度不对
现象：分层不清，水相上清带白色絮状物，A260/230偏低。
原理：氯仿比例不对、离心温度偏高，蛋白和DNA都会残留在水相。4°C离心能压住RNase活性，室温离心等于给酶加buff。
解决：每1 mL Trizol加200 µL氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟，4°C、12000 g离心15分钟。吸上清只取水相的70%-80%，别贪多。
验证：上清应该清亮无色。带絮状物就再补一次氯仿抽提。
5. 异丙醇沉淀和乙醇洗涤的细节
现象：沉淀少、发黄，或者沉淀里能看到盐结晶。
原理：异丙醇沉淀需要足够盐浓度和时间；75%乙醇如果没预冷，或者洗完后乙醇没挥发干净，残留乙醇会抑制下游酶反应。
解决：每1 mL Trizol加500 µL异丙醇，-20°C静置30分钟（微量样品过夜），4°C、12000 g离心10分钟。弃上清加1 mL预冷75%乙醇，4°C、7500 g离心5分钟，重复一次。开盖室温晾5-10分钟，别晾到沉淀透明干裂。
验证：沉淀是白色半透明小点就对了。加30 µL无RNase水，55-60°C水浴10分钟助溶。
6. 洗脱和保存环节
现象：刚提完跑胶很好，-80°C放两周再跑全是弥散。
原理：洗脱液pH偏酸（低于7）会让RNA在储存中缓慢水解；反复冻融会打断长链。
解决：用pH 7.5-8.0的无RNase水或TE洗脱，分装成每管10 µL，-80°C保存，取用放冰上，别整管反复冻融。
验证：新提的和冻存两周的样品并排跑胶，28S/18S