来源：Western Blot无信号排查方法（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完WB，ECL压片一片空白。Marker亮了，目标没亮。或者连Marker都没转过去。这种时刻最抓狂。别急着扔膜，也别立刻换抗体。本文按实验顺序，从样本制备、电泳转膜、封闭孵育到显影，给你一套可操作的排查路径。每个问题都有判断方法和解决参数。照着做，大概率能定位。
第一步：快速排查低级错误
1. 抗体种属配错？一抗兔来源，二抗用了抗鼠。看抗体管标签，二抗必须与一抗种属匹配。
2. 转膜方向反了？胶靠近负极，膜靠近正极。断电后看膜上有没有marker，没转过去就是方向错。
3. ECL工作液失效？A液和B液1:1混合，现配现用。放4°C超过一周的旧液直接换。
4. 样本里没目标蛋白？阳性对照裂解液没跑，或者细胞处理错了。换已知表达的目标细胞做阳性对照。
第二步：分维度系统排查
1. 样本制备问题
现象：所有泳道无信号，连内参也弱。
原理：裂解不充分，蛋白降解，上样量太低。
解决步骤：① 每10^6细胞加100μL RIPA，临用前加PMSF和蛋白酶抑制剂。② 冰上裂解30min，每10min vortex 10s。③ 4°C 12000g离心15min，取上清。④ BCA定量，上样20-30μg。
验证方法：跑GAPDH或β-actin，看内参条带是否均一。内参弱，先解决样本。
2. 电泳与转膜问题
现象：Marker转过去了，目标蛋白无信号。或者Marker也没转过去。
原理：转膜方向、电流、时间不对，膜孔径不合适。
解决步骤：① 确认三明治：负极-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极。② 湿转100V 90min，冰浴；或恒流200mA 120min。③ >20kDa用0.45μm膜，<20kDa用0.22μm膜。④ 转膜后丽春红染膜，看总蛋白。
验证方法：丽春红染色，膜上有红色条带说明转膜成功。没颜色，转膜失败。
3. 封闭与抗体孵育问题
现象：背景高，无特异性条带。或者完全无信号。
原理：封闭不充分，抗体浓度低，孵育时间短，洗膜过度。
解决步骤：① 5%脱脂奶粉/TBST封闭，室温1h。磷酸化蛋白用5% BSA。② 一抗按说明书1:1000稀释，4°C过夜。③ 二抗1:5000，室温1h。④ TBST洗3×10min，别超过。
验证方法：用阳性对照一抗，或点样已知阳性裂解液。一抗不工作，换批次。
4. 显影与ECL问题
现象：膜上无荧光，曝光后全黑或全白。
原理：ECL失效，曝光时间不对，相机设置错误。
解决步骤：① ECL A:B=1:1，均匀覆盖膜，