来源：蛋白诱导表达量低诱导时机（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做了三天，SDS-PAGE上诱导泳道和未诱导泳道长得一模一样。你开始怀疑质粒错了、菌死了、IPTG是水货。先别急着换质粒重做克隆。蛋白表达量低，七成问题出在诱导前那几步——种子液状态、OD600、培养基成分、诱导温度和时长。这篇按时间顺序，从转接一路查到收菌，每个原因都给你判断手法、验证方式和具体参数，照着做一遍，大概率能定位是哪一环掉链子。
第一步：先花20分钟排除低级错误
1. IPTG母液和加入量算错。 1 M IPTG水溶液（0.22 µm过滤，-20°C避光保存），每100 mL培养物加50 µL才是0.5 mM。有人误把母液当工作液用，或者母液反复冻融三次以上，活性明显下降。解决：重配1 M母液，分装成1 mL小管，现用现取。
2. 抗生素失效。 Amp在37°C摇24 h基本降解完，质粒跟着丢。换成carbenicillin（终浓度50 µg/mL），或者诱导前补加一次Amp。这招最省事。
3. 菌株和质粒不匹配。 pET系列必须用带DE3溶原的宿主，比如BL21(DE3)。丢进普通DH5α里，T7 RNA聚合酶根本不表达。查质粒启动子，再对宿主基因型，别想当然。
4. 上样量不够。 1 mL菌液在OD600 0.6时约含0.5-1 mg总蛋白，超声后每泳道上样15-20 µL。只上5 µL看不到条带，太正常了。标准化操作：每泳道对应相同菌量（OD600×体积=常数）。
第二步：分维度系统排查
模块A：诱导前——种子和菌体状态
1. 种子液老化。 现象：诱导后菌长得慢，OD半天不动，目标带极弱。原理：过夜超过16 h，菌进稳定期，质粒丢失比例上升，胞内蛋白酶积累。解决：从新鲜划线平板挑单克隆，5 mL LB加抗生素，37°C、220 rpm摇12-14 h，再按1:100转接主培养。验证：种子OD600应≤4；取100 µL涂抗性平板，菌落数远低于理论值就说明质粒丢了。
2. 诱导时机错位。 现象：早诱导菌量不够，晚诱导背景杂带一堆、目标带反而淡。原理：OD600 0.4-0.6时菌处对数中期，核糖体活跃、质粒拷贝数高；OD600超过0.8后，大部分资源转向应激蛋白和蛋白酶。解决：37°C、220 rpm培养，每20-30 min取样测OD600，到0.4-0.6立即降温到目标温度再加IPTG。验证