来源：测序接头污染高磁珠纯化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完 Bioanalyzer，看到 120–140 bp 那个尖峰，心就凉了半截。它就是接头二聚体。它占着 qPCR 定量的位置，把你的文库浓度虚高好几倍；上机后疯狂吃 reads，最后拿到的数据一半是废的。这篇教程只干一件事：把「接头污染 + 高比例磁珠纯化」的排查路径拆成可执行动作，从新手常犯的低级错误，到老手也会翻车的进阶疑难，一步步带你把那根尖峰压下去。
第一步：先别怀疑磁珠，这4个错误查了吗
- 磁珠没回温：4°C 拿出来的 AMPure XP 直接吸，结合效率能掉三成。提前 30 分钟放室温，用前涡旋 10 秒。
- 乙醇不是现配的：80% 乙醇放一周，酒精挥发后浓度变了，盐洗不干净，短片段也带不下来。每次现配 5 mL，标日期。
- 洗脱体积吸多了：洗脱 22 µL 却吸了 25 µL 上清，磁珠颗粒进枪头。宁可少吸 2 µL。
- 洗脱前没晾干：残乙醇超过 5%，下游 PCR 直接打折扣。开盖晾 3–5 分钟，磁珠表面由亮变哑光就停。
第二步：按流程分模块，逐段锁死污染源
接头二聚体的分子量在 120–140 bp。它怎么来的？接头浓度过高、连接时间过长、纯化比例太松，三者任意一个成立，它就在库里安家。下面按「连接前 → 连接中 → 纯化 → 定量」四段排查。
1. 接头稀释与投入量（连接前）
现象：不管怎么纯化，120 bp 尖峰总在，峰高甚至盖过主峰。
原理：接头是双链寡核苷酸。浓度太高时两端互补配对，自己连成二聚体，插入片段根本没机会接上。
解决：接头从 10 µM 稀释到 0.6–1.5 µM 再用。看投入量定——投入 100 ng 以上用 1.5 µM，投入 10–50 ng 用 0.6 µM。连接体系保持 20 µL，别为了省接头把体积压到 10 µL。
验证：接一组「无插入片段」的阴性对照，跑毛细管电泳。阴性对照也出 120 bp 峰，就是接头浓度问题。
2. 连接反应条件（连接中）
现象：主峰正常，但 120 bp 肩峰拖尾，纯化一次去不干净。
原理：T4 连接酶 20°C 孵育 15 分钟是标准。超过 30 分钟，平末端随机连接概率上升，二聚体累积。
解决：20°C 严格孵育 15 分钟，然后 65°C 灭活 10 分钟。连接酶从 400 U 降到 200 U 也有效，前提是末端修复做到位。
验证：同批样本做 15 分钟和 30 分钟两个条件，跑 TapeStation D1000，比 120 bp 区的摩尔占比。
3. 磁珠比例（纯化核心）
现象：用 1.0× 或 1.2× 磁珠纯化后，120 bp 峰依然显眼。
原理：SPRI 磁珠选择性结合大片段。比例越低，保留的片段越大。1.8× 大致保留 100 bp 以上，0.8× 只保留 250 bp 以上。想去掉 120 bp 二聚体，比例就得往上抬。
解决：首轮做 1.8× 纯化富集文库——加磁珠后室温孵育 5 分钟，上磁力架静置 2–3 分钟至液体澄清，弃上清，80% 乙醇洗两遍，每遍 30 秒，开盖晾 3 分钟，加 22 µL 无核酸酶水，室温 2 分钟后上架，取 20 µL 上清。第二轮对洗脱产物再加 1.8× 磁珠，二聚体在两次结合中被稀释掉。想更狠一点，第二轮改成 0.6× 做右选。
验证：每轮纯化后取 1 µL 跑 Bioanalyzer HS DNA，盯 120 bp 峰面积占比。目标压到 5% 以下。
4. 定量与上机前把关
现象：Qubit 定量 20 ng/µL 挺漂亮，上机后 cluster 数正常但数据质量差。
原理：Qubit 测的是双链 DNA 总量。二聚体也是双链，它被算进去了。qPCR 用 P5/P7 引物扩增，同样扩二聚体。
解决：用 qPCR 做文库定量，同时看 Bioanalyzer 的摩尔占比再决定上机浓度。二聚体占比超过 10%，宁可重做一轮纯化，别硬上。
验证：上机前跑一次 KAPA qPCR，配上 TapeStation，两个数据对上了再