来源：单细胞建库cDNA产量低逆转录酶（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
单细胞建库做到 cDNA 产量低，最让人崩溃。细胞明明在，裂解也做了，qPCR 却 Cq 30+，Bioanalyzer 只剩一堆引物峰。十有八九是逆转录这步没跑通。本文把 Smart-seq2、10x 和手动建库常见坑串起来，从裂解、RT 体系、TSO 到纯化扩增，按流程给你排查动作。别急着换试剂盒，先看下面的步骤。
第一步：快速排查低级错误
1. 细胞根本没进孔，或裂解不充分。
现象是阴性孔和样本孔 Cq 差不多。解决：显微镜确认单细胞入孔，裂解液用 0.2% Triton X-100，65°C 3 min，立刻冰上 2 min。
2. RNase 污染，RNA 被啃光。
枪头、水、台面都可能带酶。解决：换无 RNase 水，加 2 U/µL RNase inhibitor，操作台用 70% 乙醇擦，耗材 121°C 20 min 灭活。
3. 逆转录酶反复冻融或漏加。
RT 酶活性一天比一天低。解决：酶分装 5 µL/管，-20°C 或 -80°C 存放，用前冰上化，别放室温超过 10 min。
4. dNTP、引物浓度拿错。
Oligo-dT 少加一半，cDNA 直接腰斩。解决：配 10× 预混液，每次加 2 µL，引物终浓度 2.5 µM，dNTP 终浓度 1 mM。
第二步：分维度系统排查
1. 裂解与 RNA 完整性模块。
现象：cDNA 产量低于 1 ng/µL，或 5' 端严重丢失。原理：单细胞总 RNA 约 10 pg，mRNA 只占 1%–5%，裂解过头会放 RNase，裂解不足则 RNA 出不来。解决：先 65°C 3 min 热裂解，再冰上 2 min；裂解液现配，0.2% Triton X-100、2 U/µL RNase inhibitor、2.5 mM dNTP、2.5 µM oligo-dT。验证：加 1 µL 1:1000 ERCC spike-in，建库后看 ERCC 回收率，低于 30% 就查裂解和 RNase。
2. 逆转录酶选择与反应条件模块。
现象：短片段多，长 mRNA 逆转录不到，TSO 掺入低。原理：RT 酶持续合成能力、热稳定性和模板转换活性差别大。SuperScript II 适合 42°C 90 min，Maxima H- 可 53°C 45 min，10x 体系常用 53°C 45 min、85°C 5 min。解决：按酶换条件。SuperScript II：100 U，42°C 90 min，70°C 15 min；Maxima H-：200 U，53°C 45 min，85°C 5 min。加 5 mM DTT、6 mM MgCl2、1 M betaine 帮二级结构打开。验证：用 10 pg–1 ng 阳性 RNA 做梯度，qPCR 查 GAPDH 和 ACTB，Cq 应随模板量线性下降。
3. 引物、TSO 与 dNTP 模块。
现象：cDNA 弥散在 0.5–2 kb，但产量低，5' 端截短。原理：Oligo-dT 结合 poly(A) 尾，RT 到 5' 端加 C，TSO 带 LNA-rG 配对。TSO 少了，第二链起不来。解决：TSO 终浓度 1–2 µM，序列用 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3'；oligo-dT 2.5 µM，dNTP 1 mM。退火 42°C 90 min 或 53°C 45 min。验证：用 TSO 引物做 qPCR，或测序看 5' 端覆盖，截短比例高就检查 TSO 和 RT 温度。
4. 抑制剂与纯化模块。
现象：阳性对照也低，换酶没用。原理：胍盐、乙醇、EDTA、肝素、磁珠残留会压 RT 活性。解决：磁珠纯化用 80