来源：细胞污染支原体清除抗生素轮换（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞长得慢，上清不浑，PCR却阳性。加抗生素压下去，传两代又回来。这种支原体污染最磨人。本文覆盖：怎么确认污染、怎么选抗生素、怎么设计轮换、处理期间怎么操作、停药后怎么验证。别急着丢细胞，照下面步骤走。
第一步：快速排查低级错误
1. 血清或培养基带毒？换新批次，血清56°C灭活30分钟，再用0.1 µm滤膜过滤，旧批次直接做支原体PCR。
2. 移液器、水浴、培养箱交叉污染？每株细胞专用移液器，水浴加0.1%支原体杀灭剂，培养箱每周用70%乙醇擦托盘。
3. 抗生素浓度不够或一直低剂量维持？预防剂量压不住，治疗用Plasmocin 25 µg/mL，别用5 µg/mL糊弄。
4. 细胞太密、换液太少？T25瓶加5 mL培养基，密度降到70%，每2天换液一次再上药。
第二步：分维度系统排查
1. 污染确认与分级
现象：细胞形态变差、生长慢，但上清不浊。原理：支原体无细胞壁，不引起明显浑浊，却消耗营养、改变膜抗原。解决步骤：取培养3天上清200 µL，12,000×g离心10分钟，弃上清，加50 µL裂解液，95°C 10分钟，取2 µL做16S rRNA PCR。同时做Hoechst 33258染色，1 µg/mL染10分钟，荧光显微镜看细胞外点状荧光。验证方法：PCR阴性且Hoechst无胞外荧光，才叫干净。阳性先别用药，先确认不是引物污染。
2. 抗生素选择与轮换设计
现象：单用Plasmocin 14天后PCR转阴，停药传2代又阳性。原理：支原体可产生耐药，同类抗生素轮换等于没换。解决步骤：第1轮Plasmocin 25 µg/mL，37°C、5% CO2处理14天；停3天；第2轮MRA 0.5 µg/mL处理7天；停3天；第3轮BM-Cyclin，10 µg/mL tiamulin + 5 µg/mL minocycline处理7天。每轮之间做一次PCR。验证方法：每轮结束PCR，若仍阳性，延长该轮至21天，别直接换药。
细胞死太多？Plasmocin降到12.5 µg/mL，延长到21天。别低于治疗浓度。
3. 处理期间培养操作
现象：用药后细胞大片脱落，或第7天污染反弹。原理：支原体附着细胞膜，换液不彻底会残留。解决步骤：每天观察，每2天换液，T25用5 mL，PBS洗2次再换含药培养基。刮洗瓶壁，别只轻柔冲洗。离心传代时，300×g 5分钟，弃上清，PBS重悬再离心一次。验证方法：处理第7天取上清PCR，若