来源：RNA提取降解RNase去除（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
RNA提取失败，最扎心的不是没产量，是电泳图一坨弥散，qPCR CT值还往后跑。你明明换了新试剂盒，A260/280却只有1.6，28S:18S倒过来。别急着怪柱子。这篇按样品、裂解、相分离、沉淀、洗脱、RNase去除逐段排查。给你具体体积、时间、温度和验证动作。
第一步：快速排查低级错误
1. 手套没换就摸离心机盖？手是RNase重灾区。解决：戴无粉手套，每碰一次门把手、笔、手机就换。
2. 枪头和管子不是无RNase认证？普通耗材残留RNase。解决：用带“RNase-free”认证吸头，开袋前喷RNaseZap，静置1分钟。
3. DEPC水没配好？0.1% DEPC，37°C过夜，121°C 20分钟。Tris不能用DEPC，会反应，得用新开封或DEPC水配。
4. 样品离体没速冻？内源RNase几秒就启动。解决：液氮速冻，或RNAlater 4°C过夜后转-80°C，别反复冻融。
第二步：分维度系统排查
1. 样品采集与保存
现象：RNA电泳28S/18S模糊，RIN只有4-6。原理：离体后内源RNase立即释放。解决：组织取≤100 mg，液氮研磨成粉，加1 mL TRIzol；细胞用PBS洗一次，直接加1 mL TRIzol，别先离心成干pellet。验证：取1 µL测NanoDrop，A260/280应在1.9-2.1；跑1%琼脂糖，28S:18S约2:1。
2. 裂解与匀浆
现象：裂解液粘稠、堵枪头，产量低。原理：裂解不完全，RNA没释放，RNase没变性。解决：组织加1 mL TRIzol，电动匀浆器15-30秒，冰上间歇；细胞每10 cm²加1 mL，反复吹打10次。室温静置5分钟。验证：裂解液应透明不粘，无肉眼颗粒。
3. 相分离
现象：中间层厚，水相少，A260/230低。原理：氯仿比例、pH和离心温度影响分层。解决：每1 mL TRIzol加200 µL氯仿，剧烈振荡15秒，室温3分钟，12,000×g 4°C离心15分钟。吸上层水相400-500 µL，别碰中间层。验证：水相约初始TRIzol体积的50-60%。
4. 沉淀与洗涤
现象：沉淀发黄或发褐，A260/230<1.8。原理：酚、盐、多糖残留。解决：加500 µL异丙醇，室温10分钟，12,000×g 4°C离心10分钟。弃上清，加1 mL 75%乙醇，涡旋，7,500×g 4°C离心5分钟，重复一次。空气干燥5-10分钟，别全干。验证：沉淀应白色半透明。
5. 溶解与保存
现象：RNA难溶，或放两天就降解。原理：过度干燥、反复冻融、水相RNase残留。解决：加20-50 µL RNase-free水或TE，55°C 10分钟，轻弹溶解。分装5-10 µL，-80°C保存。验证：A260/280 1.9-2.1，A260/230>2.0。
6. RNase去除
现象：新提RNA也降解，空白水对照也出条带。原理：台面、耗材、试剂带入RNase。解决：台面喷RNaseZap，静置1分钟擦干；玻璃器皿180°C烘4小时；DEPC水0.1%处理，37°C过夜后121°C 20分钟；Tris、HEPES用新开封。加RNasin 20-40 U/µL。验证：设空白水+RNasin，37°C孵育1小时，电泳无弥散。
第三步：进阶疑难问题
1. 富含RNase组织
胰腺、脾、肝，裂解后马上降解。现象：加TRIzol前就发粘，RNA得率低。解决：液氮研磨后直接加预冷TRIzol，匀浆后立即加氯仿；裂解液加1% β-巯基乙醇。验证：RIN>7，28S:18S≈2:1。
2. 植物多糖多酚样本
现象：沉淀粘，A260/230<1.5。原理：多糖多酚抑制酶和柱膜。解决：裂解液加2% PVP和1% β-巯基乙醇，氯仿抽提两次，加1/10体积3 M NaOAc pH 5.2和2.5倍乙醇，-20°C 2小时。验证：跑胶无拖尾，qPCR无抑制。
3. 微量样本
现象：得率<10 ng/µL，qPCR失败。解决：加10 µg糖原或carrier RNA，用低吸附管，洗脱20 µL，真空浓缩。验证：Bioanalyzer RIN>6，或qPCR标准曲线扩增效率90-110%。
避坑总结+实操建议
三条核心结论。降解多半发生在加TRIzol之前，离体30秒内速冻。RNase去除靠耗材和溶液，不靠