来源：双向电泳横纹纵纹聚焦时间（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑双向电泳最崩溃的瞬间，不是胶没染上色，是染上了一看——每个蛋白点都拖着横的、竖的尾巴，像被谁拿刷子糊过。横纹纵纹同时出现，十有八九跟聚焦时间脱不了干系，但也可能被样品、泡涨、平衡环节牵连。这篇教程按操作顺序拆开讲，从低级错误到进阶疑难，给你一套能直接照做的排查路径。
第一步：先看这几个新手最常犯的错
1. 样品盐浓度没降下来。 盐超过50 mM，聚焦时电流压不住，电压爬不上去，横纹必来。解决：TCA/丙酮沉淀或透析，让电导率低于500 µS/cm。
2. IPG buffer 忘加或加少。 泡涨液里没加0.5%（v/v）载体两性电解质，pH梯度建不起来。解决：按胶条长度补足，7 cm加125 µL体系里至少0.6 µL。
3. 泡涨时间不够就上机。 泡涨低于8小时，胶条吸水不均，碱性端尤其明显。解决：室温泡涨12–16小时，过夜最稳。
4. 聚焦Vh直接抄别人的。 7 cm胶条用24 cm的参数，聚焦时间翻几倍，蛋白点碳化、纵纹拉长。解决：按胶条长度算总伏特小时。
第二步：按流程分模块系统排查
模块一：样品制备——横纹的最大来源
现象： 全胶面横向拖尾，酸性端和碱性端都糊。
原理： 盐离子、核酸、脂类、残留去污剂会抢占电流，让蛋白没法在等电点停住，横向漂移。
解决步骤：
1. 取100 µg蛋白（7 cm胶条银染量），加4倍体积冷丙酮含10% TCA，-20°C静置2小时。
2. 4°C、15000 g离心15分钟，弃上清，沉淀用冷丙酮洗两次。
3. 空气干燥5分钟，用含8 M尿素、2% CHAPS、0.5% IPG buffer的裂解液复溶。
4. 测电导率，高于500 µS/cm就再沉淀一次。
验证方法： 取5 µL样品加245 µL水测电导，或用pH试纸确认无酸性残留。
模块二：泡涨与上样——纵纹的隐形推手
现象： 纵纹沿pH梯度方向拉长，点与点之间连成竖线。
原理： 泡涨液体积不足，胶条局部干湿不均，蛋白在吸水过程中被“冲”到某一区域，聚焦时纵向堆积。
解决步骤：
1. 7 cm胶条用125 µL泡涨液，17 cm用300 µL，24 cm用450 µL。
2. 泡涨盘水平放置，胶条胶面朝下，避免气泡。
3. 上样量别贪：7 cm银染20–50 µg，考染100–200 µg；17 cm银染100–300 µg。
4. 上样后覆盖1 mL矿物油，防蒸发。
验证方法： 泡涨后胶条应均匀膨胀，无白斑，手指轻压有弹性。
模块三：IEF聚焦时间——横纹纵纹的共同开关
现象： 横纹为主说明聚焦不足；纵纹加深、点变扁说明聚焦过度。
原理： 聚焦时间不够，蛋白没走到等电点，横向扩散；时间过长，蛋白在碱性端脱酰胺或碳化，纵向拖尾。
解决步骤：
1. 按胶条长度定总Vh：7 cm约8–10 kVh，11 cm约15–20 kVh，17 cm约30–40 kVh，24 cm约60–80 kVh。
2. 电压爬升程序：250 V 30分钟→500 V 30分钟→1000 V 1小时→8000 V至目标Vh。
3. 温度设20°C，电流上限50 µA/胶条。
4. 聚焦结束后立即进行平衡，别把胶条泡在矿物油里过夜。
验证方法： 聚焦完的胶条，碱性端应无蓝色溴酚蓝残留；用pH梯度试纸贴胶条两端，确认pH范围匹配。
模块四：平衡与第二维——纵纹的最后一关
现象： 纵纹从胶条边缘向SDS-PAGE胶内延伸，条带歪斜。
原理： 平衡不充分，DTT和碘乙酰胺反应不完全，蛋白未彻底还原烷基化，第二维电泳时继续纵向迁移。
解决步骤：
1. 平衡液A：含10 mg/mL DTT，室温15分钟。
2. 平衡液B：含25 mg/mL碘乙酰胺，室温15分钟。
3. 胶条转移时用滤纸吸去多余平衡液，别用水洗。
4. 第二维SDS-PAGE用12%分离胶，恒定电流15 mA/胶，直到溴酚蓝跑出。
验证方法： 平衡后胶条应呈半透明，无白色沉淀；第二维胶上蛋白点圆整，无竖线。
第三步：进阶疑难，老手也会踩的坑
1. 只有碱性区横纹。 pH>8区域反向电渗流强，蛋白容易沉淀。试试在泡涨液里加0.1% Triton X-100，或改用碱性专用胶条。聚焦时间别超过目标Vh的10%。
2. 聚焦过度导致纵纹。 总Vh超出推荐值20%以上，天冬酰胺脱酰胺，蛋白点变多个竖点。直接看碱性端，如果点被拉成竖线，下次把Vh降15%。
3. 温度波动。 聚焦仪散热不良，局部过热，胶条中间出现横向焦糊纹。摸一下聚焦盘，烫手就是问题。设20°C，别开盖跑。
避坑总结+实操建议
三条核心结论：
- 横纹先查盐和聚焦时间，纵纹先查泡涨和平衡。
- 聚焦Vh按胶条长度算，别跨规格套参数。
- 上样量宁少勿多，过载的横纹纵纹最难救。
两条日常好习惯：
- 每次配泡涨液现用现加IPG buffer，别囤。
- 聚焦完立刻平衡，拖延超过10分钟纵纹概率翻倍。
工具推荐
样品制备阶段，如果蛋白本身可溶性差，跑双向电泳前先用蛋白可溶性优化工具评估一下标签和表达条件，能省掉很多横纹麻烦。需要做后续质谱鉴定的话，引物设计工具可以帮你快速拿到目标基因的扩增引物；做异源表达时，密码子优化工具能提高表达量，让上样量更从容。这几个工具在站内都能直接调用，按需取用。