来源：细胞污染黑点游动支原体检测（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
镜下看见黑点漂，培养液发黄，细胞突然不长——你第一反应是支原体？别急。黑点会游动，多半不是支原体。支原体本身在普通显微镜下看不见，它污染后培养液也不一定浑浊。真正要排查的是细菌、真菌、细胞碎片、血清析出，还有交叉污染。这篇教程从低级错误到进阶疑难，把“黑点+游动+支原体检测”的完整排查路径拆开。每一步给具体参数、判断动作和验证方法，直接照着做。
第一步：快速排查低级错误
1. 培养基或血清瓶盖没拧紧，水浴锅成了污染源。 刚换液24小时就浑浊、黑点满视野，大概率是这瓶试剂已经污染。直接弃用这瓶，水浴锅用75%乙醇擦内壁，紫外照射30分钟，血清按需56°C灭活30分钟。
2. 枪头盒开封太久，移液器杆没喷酒精。 操作时枪头碰到台面、手套，污染就进去了。枪头必须高压灭菌，移液器杆每次用75%乙醇擦拭，超净台紫外30分钟，风机预吹5分钟再操作。
3. 培养箱水盘加自来水，两周不换。 水盘是霉菌和细菌的温床。清空水盘，用0.5%次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水冲洗3次，再加无菌水，每2周换一次。
4. 细胞本身已经污染，还接着传代。 复苏管口没灼烧，DMSO残留，或者旧培养瓶里早就有黑点。别救了。新复苏一支，换新培养基，加1%青霉素-链霉素双抗，37°C、5% CO₂培养观察。
第二步：分维度系统排查
1. 先镜检，区分黑点类型
现象描述： 100×镜下黑点做布朗运动，400×下见短杆或球状，培养液可能变黄。
原理说明： 细菌自主游动，细胞碎片只是随液流漂。支原体无细胞壁，普通镜检看不到。
解决步骤： 取10 μL培养上清滴载玻片，盖盖玻片，100×和400×各看一遍。黑点沿液流走，是碎片；自己打转，是细菌。
验证方法： 涂片革兰染色，见紫色或红色菌体，细菌阳性。
2. 细菌污染处理
现象描述： 培养基24小时内变黄、浑浊，细胞间密集黑点，细胞圆缩脱落。
原理说明： 细菌代谢产酸，消耗营养，直接压过细胞生长。
解决步骤： 弃上清，PBS洗3次，加0.25%胰酶-EDTA 1 mL，室温消化2分钟，加含10% FBS培养基终止，加青霉素100 U/mL+链霉素100 μg/mL，37°C、5% CO₂培养。严重污染直接丢弃。
验证方法： 取100 μL上清涂LB平板，37°C过夜，有菌落即阳性；无抗生素培养3天，镜检无游动黑点。
3. 真菌和酵母污染
现象描述： 肉眼见丝状、绒毛状悬浮物，镜下见菌丝或出芽酵母。
原理说明： 孢子通过空气、水盘扩散，污染后蔓延快。
解决步骤： 立即隔离该瓶，培养箱用75%乙醇擦拭+紫外30分钟，耗材全部高压。细胞可加两性霉素B 2.5 μg/mL处理，但毒性大，珍贵细胞先扩增。
验证方法： 取上清涂沙保弱平板，28°C培养48小时，有菌落即阳性。
4. 支原体检测
现象描述： 细胞生长慢、形态变、贴壁差，培养液不浑浊，普通镜检无黑点。
原理说明： 支原体直径0.1-0.3 μm，能通过0.22 μm滤器，污染后不引起明显浑浊，但耗营养、改代谢。
解决步骤： 取1 mL上清，12000×g、4°C离心10分钟，弃900 μL，留100 μL，95°C加热10分钟裂解。用16S rRNA引物做qPCR：95°C 30秒；95°C 5秒，60°C 30秒，40循环。或Hoechst 33342 1 μg/mL，37°C染色10分钟，荧光镜看细胞外蓝点。
验证方法： 设阳性对照、阴性对照、无模板对照。Ct≤35判阳性，35-38复检，>38阴性。连续两次阴性才放行。
5. 交叉污染排查
现象描述： 多瓶细胞同时出现黑点或支原体阳性。
原理说明： 共用培养基、胰酶、PBS，污染通过试剂扩散。
解决步骤： 培养基分装50 mL/管，胰酶0.5 mL/管，每瓶专用。操作时先处理阴性细胞，再处理阳性细胞。
验证方法： 每批新试剂取5 mL加10 mL培养基，37°C培养48小时，镜检无污染再用。
6. 支原体清除
现象描述： qPCR阳性，但细胞珍贵，不想扔。
原理说明： 支原体无细胞壁，青霉素无效，需用干扰蛋白合成或DNA复制的抗生素。
解决步骤： Plasmocin 25 μg/mL处理2周，再5 μg/mL处理1周；或环丙沙星10 μg/mL+四环素5 μg/mL处理14天。每3