来源：支原体qPCR假阳性引物二聚体（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
NTC孔一起峰，心就凉半截。支原体qPCR假阳性大概是最磨人的一类问题——你明明没加模板，机器却告诉你"有扩增"。别急着怀疑细胞污染，八成是引物二聚体在作怪。这篇按"低级错误→分维度排查→进阶疑难"三层走，每一步都给判断标准、验证动作和具体参数，你对着做就行。
第一步：先花10分钟排掉低级错误
1. 引物终浓度配太高。 很多人把10 µM母液直接按1:1加，终浓度跑到0.5-1 µM，二聚体想不形成都难。把每条引物终浓度压到0.2 µM再跑一遍。
2. 模板真的没加，或者加得太少。 加样漏孔、模板稀释过度（<10拷贝），没有真靶标来竞争，二聚体自己就扩起来了。先确认模板孔有没有Ct，再看NTC。
3. Mg²⁺或dNTP浓度超标。 2.5 mM Mg²⁺是常规值，跑到4-5 mM二聚体明显增多。核对缓冲液配方，别把含Mg的buffer和MgCl₂叠加加进去。
4. 阴性对照被气溶胶污染。 枪头反复用、开盖动作太大、超净台风速不对。换新枪头、NTC最后加、加样区和配液区物理分开。
第二步：分模块系统排查
A. 引物本身有没有问题
现象：NTC孔Ct 30-35，熔解曲线在75-80°C冒出一个小峰，主产物峰的Tm在88°C以上。
原理：SYBR Green法里，只要形成双链就出荧光。引物3'端有2个以上连续互补碱基，Taq聚合酶就能把它当模板延伸，几十个循环后浓度足够被检出。这条路径不需要任何模板。
解决：把引物序列丢进二聚体分析工具，看两个指标——3'端连续互补碱基数不能≥2，自二聚体ΔG不能低于-6 kcal/mol。不合格的直接重设计，扩增子控制在100-200 bp。不想重设计就先降浓度：0.05-0.1 µM，很多二聚体会直接消失。
验证：用10%非变性PAGE跑引物对，120 V电泳60分钟，银染或EB染色。出现小于50 bp的弥散条带，就是二聚体实锤。也可以从熔解曲线上看——二聚体峰在75-80°C，主峰在85-90°C，位置和形状都对不上。
B. 退火温度和时间有没有压住
现象：换了引物后还是NTC起峰，但Ct往后推迟了2-3个循环。
原理：退火温度越低，非特异结合越容易。55°C退火下，很多本来不稳定的引物配对也能形成。
解决：跑一次温度梯度，55、58、60、62、65°C各两孔。多数支原体16S引物在60-62°C能干净扩增，同时把二聚体压到检测限以下。用两步法（95°C 15 s → 60°C 60 s）代替三步法，程序更简洁，二聚体机会更少。循环数别超过40，38-40循环时二聚体累积量比35循环高一个量级。
验证：跑完看NTC孔，Ct值应该落在37以上或者干脆无Ct；阳性对照的Ct不能往后推迟超过1.5个循环。两头都得看。
C. 反应组分和仪器有没有拖后腿
现象：同一个模板，A仪器正常，B仪器NTC出小峰。
原理：SYBR Green I浓度过高会抑制扩增效率；Mg²⁺偏高会降低配对严格度；ROX校正没做，基线漂移，自动阈值把噪音当信号。
解决：Mg