来源：J Agric Food Chem | 编译：DNA Lab Space
一种从德国黑森林国家公园朽木上分离的珍稀白腐真菌，竟能在液体培养中大量分泌红色抗菌色素卵孢霉素。德国研究人员通过多组学与分子动力学模拟相结合的策略，不仅锁定了催化该化合物合成的关键酶系，还建立了无孢子、高产量、可放大的生产平台。这项研究为利用受保护真菌资源开发生物农药提供了全新范式。
研究背景
化学农药的长期大量使用带来了害虫抗药性、环境污染和食品安全等一系列问题。寻找环境友好型生物防治剂成为农业可持续发展的迫切需求。卵孢霉素（oosporein）是一种红色二苯并醌类化合物，由多种真菌产生，展现出良好的杀虫活性，被认为是替代传统化学农药的潜力候选分子。
然而，卵孢霉素的生产面临两大瓶颈：一是天然产生菌株产量低，二是部分产菌株在培养过程中会产生大量孢子，给工业发酵带来安全隐患。Phlebia centrifuga是一种栖息于针叶树朽木上的白腐真菌，此前从未有报道称其能够产生卵孢霉素。研究人员从德国黑森林国家公园的原始保护区内采集到这种珍稀真菌的子实体，并成功分离纯培养物。本研究旨在探索该菌株生产卵孢霉素的能力，并借助多组学手段揭示其生物合成途径。
研究方法
菌株分离与保藏
研究团队在黑森林国家公园"Wilder See"保护区内的针叶朽木（云杉/冷杉死木）上采集了P. centrifuga子实体，样本编号KR-M-0090335，坐标为48.5690953°N, 8.2377273°E。通过孢子释放法在麦芽酵母蛋白胨琼脂培养基（含7 g/L麦芽提取物、0.5 g/L酵母提取物、1 g/L大豆蛋白胨和15 g/L琼脂）上获得纯培养物。待菌丝覆盖平板约80%后，切取1×1 cm的菌丝块转移至麦芽提取物琼脂培养基（MEA，含30 g/L麦芽提取物和15 g/L琼脂）上长期保藏。该菌株已保藏于DSMZ菌种保藏中心，编号DSM 121802。
液体发酵与产物诱导
将P. centrifuga在马铃薯葡萄糖（PD）培养基中进行 submerged 培养。培养过程中观察到培养上清液呈现红色——这与野生子实体边缘或吐水液滴的颜色一致。为提升卵孢霉素产量，研究人员在培养体系中添加了关键中间体苔色酸（orsellinic acid，一水合物，纯度98%）。苔色酸的添加强烈诱导了卵孢霉素特异性生物合成基因的表达。
产物分离与结构鉴定
从PD培养上清液中分离红色色素，采用高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）进行结构鉴定。HRMS使用Bruker Impact II ESI-MS仪器，在ESI(+)模式下检测到m/z 307.0446 [M+H]+和329.0267 [M+Na]+，计算精确质量为306.0373 Da，据此推导出分子式为C14H10O8（质量偏差Δ = −0.87 ppm）。
1H NMR谱（溶剂为DMSO-d6）仅显示一个信号，位于δ = 1.81 ppm（单峰，6H），归属为C7/C7′位的甲基质子。13C NMR谱在DMSO-d6中仅显示三个信号，分别位于δ = 7.6、107.4和112.8 ppm，对应两个甲基碳（C7/C7′）和四个季碳（C1/C1′和C4/C4′）。由于互变异构导致羟基和羰基碳信号展宽，研究人员在13C NMR实验中加入2 M过量的三乙胺（Et3N）以消除互变异构影响。加碱后的13C NMR谱显示：δ = 8.0 ppm（C7/C7′）、107.6 ppm（C1/C1′）、108.0 ppm（C4/C4′），以及新出现的171.4 ppm（羟基取代碳C2、C5/C2′、C5′）和172.3 ppm（羰基碳）信号。
多组学基因挖掘
采用多组学方法预测编码全部必要转化步骤的酶基因。通过比较基因组学、转录组学等多维度数据整合，研究人员预测了包括I型聚酮合酶（type I polyketide synthase）、两种单加氧酶（monooxygenase）和一种血红素过氧化物酶（heme peroxidase）在内的关键酶系。
分子对接与动力学模拟
对预测的酶进行广泛分子对接分析，研究底物与酶活性位点的结合模式。在此基础上开展分子动力学模拟，评估酶-底物复合物的稳定性与构象变化，最终推导出完整的生物合成途径。
化学试剂来源
研究使用的化学试剂均购自专业供应商：琼脂、硼酸（99.8%）、d-葡萄糖一水合物、DMSO-d6（99.9 atom % D）、2-丙醇、硫酸镁一水合物（99%）、磷酸（85%）、氢氧化钠（98%）、三乙胺（99.5%）和酵母提取物购自Carl Roth；乙腈（99.9%）、乙醇（99.9%）、甲酸（99.9%）、麦芽提取物、磷酸二氢钾（99.5%）和乙酸钠购自Th. Geyer；冰醋酸、DMSO（99%）、苔色酸一水合物（98%）、马铃薯提取物和氯化钠（99.5%）购自Fisher Scientific；大豆蛋白胨和甲醇（99.9%）购自Merck；玻璃纸购自Diagonal；l-天冬酰胺一水合物购自AppliChem；卵孢霉素参比标准品（70%）购自Cayman Chemical。
研究结果
卵孢霉素的高产发酵
在未添加诱导物的PD培养基中，P. centrifuga submerged 培养已能产生肉眼可见的红色素。当向培养基中补充关键中间体苔色酸后，卵孢霉素产量大幅跃升，培养上清液中最高浓度达到1.60 g/L。这一产量水平在真菌次级代谢产物生产中相当可观，且该过程不产生孢子——对于工业发酵而言，无孢子特性意味着更安全的操作环境和更简便的下游处理。
苔色酸的添加不仅提高了产量，还强烈诱导了卵孢霉素特异性生物合成基因的转录。这一结果提示苔色酸在生物合成途径中扮演前体或诱导物的双重角色——它既是聚酮合酶的底物，又可能作为途径特异性调控信号激活沉默基因簇。
结构鉴定的关键证据
HRMS和NMR数据确凿证明了分离产物为卵孢霉素。HRMS给出的精确质量306.0373 Da与C14H10O8的理论值高度吻合（Δ = −0.87 ppm），排除了其他可能分子式。1H NMR仅显示一个甲基信号（δ = 1.81 ppm，6H），表明分子具有高度对称性——两个甲基化学等价。13C NMR在加三乙胺后解析出全部碳信号：两个甲基碳（δ = 8.0 ppm）、四个季碳（δ = 107.6 ppm和108.0 ppm）、四个羟基取代碳（δ = 171.4 ppm）和四个羰基碳（δ = 172.3 ppm）。这些数据与卵孢霉素的对称二苯并醌结构完全吻合。
生物合成途径的酶学预测
多组学分析预测了完整的卵孢霉素生物合成酶系。途径起始于I型聚酮合酶（PKS），该酶负责催化苔色酸的组装——以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为延伸单元，通过Claisen缩合反应形成聚酮链，再经环化芳香化生成苔色酸。随后，两种单加氧酶依次催化氧化步骤：第一种单加氧酶可能负责苔色酸苯环的羟基化，引入额外的酚羟基；第二种单加氧酶则可能催化二聚化前的氧化偶联。最后，血红素过氧化物酶催化两个分子间的氧化偶联，形成二苯并醌骨架。
分子对接分析揭示了各酶与底物的结合模式。动力学模拟进一步验证了催化残基的保守性和底物通道的稳定性。这些计算证据为每个酶促步骤提供了结构层面的支持，使预测的途径具有较高的可信度。
平台的可扩展性与应用潜力
该生产平台的核心优势在于"三无"特性：无孢子——消除工业发酵中的气溶胶风险；无基因操作——利用天然菌株的沉默基因簇，避免转基因生物监管限制；无昂贵添加剂——仅需苔色酸这一相对廉价的前体。结合1.60 g/L的产量，该平台在生物农药原料生产领域展现出直接的应用前景。
讨论与展望
这项研究的亮点在于将"受保护真菌"转化为"高效细胞工厂"的策略。黑森林国家公园的严格保护政策并未阻碍科研价值挖掘——研究人员通过合法采集、纯培养和DSMZ保藏，使这一珍稀资源得以进入公共菌种库。P. centrifuga DSM 121802现可供学术界和工业界使用，这为其他受保护真菌的资源化利用提供了可复制的范本。
从生物合成角度看，苔色酸的双重角色（前体+诱导物）值得深思。这一发现提示，在挖掘真菌隐性次级代谢产物时，外源添加途径中间体可能比传统的OSMAC策略（一种改变培养条件激活沉默基因簇的方法）更具针对性。多组学与分子动力学的组合拳也展示了计算生物学在天然产物途径解析中的独特价值——尤其当遗传操作工具在非模式真菌中尚不成熟时。
未来，该途径中的聚酮合酶和过氧化物酶具有异源表达的潜力。若能在大肠杆菌或酵母中重建这一途径，将彻底摆脱对野生菌株的依赖。另一个值得探索的方向是卵孢霉素的杀虫谱和田间药效——毕竟，实验室产量与田间防效之间，还隔着剂型开发、环境归趋和毒理学评价等多道关卡。该研究为这些后续工作提供了坚实的物质基础。
参考来源
Broel N, Wengner FV, Stein JV, Popa F, Janssen S. Oosporein in Phlebia centrifuga: Prediction of Key Enzymes by a Combination of Multi-Omics and Molecular Dynamics. J Agric Food Chem. PMID: 42554813.
PMID: 42554813