来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）正从实验室 curiosum 走向工业生物制造的前台。这种由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接的多糖，兼具刚性骨架与柔性链段，在食品、医药和材料领域都有想象空间。但产量上不去，一直是其规模化应用的拦路虎。近日，西班牙研究团队在《Microbial Biotechnology》发文，揭示了外膜蛋白TolC在MLG生物合成中的关键角色——它不仅是合成机器的核心部件，更是产量跃升的开关。通过共表达tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶，研究者将MLG产量推高至约10 g/L，并在非天然产MLG的根瘤菌宿主中实现了从无到有的合成。这项发现为MLG的工业化生产提供了清晰的工程路径。
研究背景
MLG是一类由β-1,3和β-1,4糖苷键混合连接而成的线性葡聚糖，广泛存在于禾本科植物细胞壁和某些细菌胞外多糖中。与纯β-1,4连接的纤维素或纯β-1,3连接的酵母葡聚糖不同，MLG的混合连接模式赋予其独特的流变学特性——它能形成热可逆凝胶，且凝胶强度与连接比例密切相关。这些性质使MLG在食品增稠剂、膳食纤维补充剂和生物材料领域具有开发价值。
在细菌中，MLG的合成研究主要集中于根瘤菌。此前工作已明确，MLG生物合成受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控，由双顺反子操纵子bgsBA介导。BgsA是糖基转移酶，负责多糖链的延伸；BgsB则被认为是膜相关蛋白，可能参与聚合物的转运或组装。然而，完整的合成机器构成一直存在盲区——BgsA和BgsB是否足以完成合成与分泌？是否还有其他蛋白参与？这些问题悬而未决。
TolC是革兰氏阴性菌中典型的outer membrane factor（OMF）家族蛋白，通常与内膜转运体形成三组分外排泵复合物，负责将底物泵出细胞外。在MLG合成中，TolC是否也扮演类似角色？本研究正是从这个疑问出发，系统考察了TolC在苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）MLG合成中的作用，并基于此构建了高产工程菌株。
研究方法
研究团队以苜蓿中华根瘤菌8530为出发菌株，系统开展了基因敲除、互补表达和共过表达实验。整个技术路线清晰：先构建tolC缺失突变体，验证其对MLG合成的影响；再通过回补实验确认表型；最后构建多基因共表达模块，在摇瓶和生物反应器两个尺度评估产量。
菌株与培养条件
供试菌株包括苜蓿中华根瘤菌、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）和菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）。常规培养采用添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY），或最小培养基（MM）。MM配方为（每升）：甘露醇10 g、谷氨酸钠1.1 g、KH₂PO₄ 0.3 g、K₂HPO₄ 0.3 g、MgSO₄·7H₂O 0.15 g、CaCl₂·2H₂O 0.05 g、FeCl₃ 0.006 g、NaCl 0.05 g，另加1 mL 1000×维生素储备液（含生物素0.2 g/L、盐酸硫胺素0.1 g/L、泛酸钠0.1 g/L）。苜蓿中华根瘤菌和日本中生根瘤菌在28°C培养，菜豆根瘤菌在30°C培养。用于克隆和接合转移的大肠杆菌在37°C LB培养基中培养。
抗生素使用浓度：四环素（Tc）10 μg/mL（菜豆根瘤菌用5 μg/mL）、卡那霉素（Km）50 μg/mL、刚果红（CR）50 μg/mL、荧光增白剂（CF）200 μg/mL、IPTG 1 mM。所有质粒通过大肠杆菌β2163或S17.1供体菌株接合转移导入根瘤菌。
tolC基因敲除与回补
采用同源重组策略在苜蓿中华根瘤菌8530中构建tolC框内缺失突变体。敲除片段经PCR验证，确认无残留基因片段。回补实验将完整tolC基因克隆至广宿主质粒，通过接合转移导入突变体，恢复其表达。
MLG产量测定
MLG定量采用地衣多糖酶（lichenase）消化法，测定释放的葡萄糖当量。具体而言，根瘤菌在100 mL锥形瓶（含20 mL液体MM培养基，添加适宜浓度Tc）中培养3天，摇床转速170 rpm，苜蓿中华根瘤菌28°C、菜豆根瘤菌30°C。初始OD₆₀₀调至0.05。培养结束后，样品经地衣多糖酶处理，释放的葡萄糖用葡萄糖氧化酶法测定，换算为MLG产量。
多基因共表达模块构建
为提升MLG产量，研究团队构建了包含tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶基因（pleD）的多基因表达模块。pleD编码的突变型地苷酸环化酶持续产生c-di-GMP，解除内源调控对MLG合成的限制。共表达模块克隆至广宿主质粒，通过接合转移导入不同根瘤菌宿主。对照质粒不含tolC，用于评估TolC对产量的独立贡献。
生物反应器放大实验
在摇瓶验证的基础上，研究团队进行了生物反应器放大实验。反应器条件原文摘要未详述具体参数，但明确提及在生物反应器条件下MLG产量可达约10 g/L。
三突变体构建
为排除其他c-di-GMP调控胞外多糖（EPS）对MLG产量的竞争影响，研究者构建了三重突变体IBR606，依次敲除wgcA（EPS II合成基因）、exoY（EPS I合成基因）和uxs1-uxe（APS合成基因）。突变依次引入，每步均经PCR确认基因型，并通过表型观察确认相应EPS缺失。
研究结果
TolC缺失完全 abolish MLG合成
这是本研究的核心发现。在苜蓿中华根瘤菌中敲除tolC后，MLG合成完全消失。回补完整tolC基因后，MLG产量恢复。这一结果清晰表明，TolC是MLG生物合成机器不可或缺的组成部分。研究者据此提出，TolC可能与BgsA、BgsB形成三组分复合物，协同完成聚合物的合成和/或分泌。这一模型与TolC在外排泵系统中的经典功能相呼应——在革兰氏阴性菌中，TolC作为外膜通道，与内膜转运体形成跨膜通道，将底物泵出细胞。在MLG合成中，TolC可能扮演类似角色，为正在延伸的多糖链提供跨外膜的出口。
共表达模块实现产量8倍提升
在确认TolC必要性的基础上，研究者构建了共表达模块。将tolC、bgsBA和pleD*共同过表达，MLG产量较不含tolC的对照质粒提升了8倍。这一数据明确量化了TolC对产量的贡献——它不仅是合成所必需，更是限速因素之一。在生物反应器条件下，该模块的MLG产量达到约10 g/L。这一数值在细菌胞外多糖生产中属于较高水平，表明该工程模块具备规模化应用潜力。
模块可移植性验证
将上述遗传模块导入日本中生根瘤菌——该菌天然不产MLG——成功实现了MLG的从头合成。这一结果证明，该模块具有跨菌种的可移植性，可作为合成生物学工具包在不同根瘤菌底盘间转移。这种"即插即用"的特性为MLG生产菌株的多样化选择提供了可能，也为未来在其他微生物中重构MLG合成途径奠定了基础。
三重突变体对MLG产量无显著影响
为探究其他c-di-GMP调控EPS是否与MLG竞争碳通量，研究者构建了敲除EPS I、EPS II和APS合成基因的三重突变体IBR606。结果表明，在生理c-di-GMP水平下，野生型MLG产量低于检测限，IBR606背景中亦无显著增加。当携带pleD*质粒提高c-di-GMP水平后，IBR606的MLG产量略高于野生型，但差异无统计学意义。这一结果排除了其他EPS对MLG产量的竞争性抑制，说明MLG合成的主要限制因素在于c-di-GMP水平和TolC/BgsBA的表达量，而非碳通量在不同EPS途径间的分配。
关键数据汇总
- tolC缺失：MLG合成完全消失
- tolC回补：MLG产量恢复
- 共表达tolC+bgsBA+pleD*：MLG产量较对照（无tolC）提升8倍
- 生物反应器条件：MLG产量约10 g/L
- 日本中生根瘤菌（非天然产MLG宿主）：实现MLG从头合成
讨论与展望
TolC的发现补齐了MLG生物合成机器的关键拼图。此前研究聚焦于BgsA和BgsB，但两者是否足以支撑完整的多糖合成与分泌，始终缺乏直接证据。本研究通过遗传学手段证明TolC不可或缺，并提出了三组分复合物的结构模型。这一模型与革兰氏阴性菌中经典的"内膜转运体-周质衔接蛋白-外膜通道"三组分外排泵架构高度一致，提示MLG合成可能采用了类似的跨膜分泌机制。
从应用角度看，8倍产量提升和10 g/L的产量水平具有明确工业价值。更为重要的是，该模块的跨菌种可移植性为合成生物学提供了标准化的"MLG合成工具箱"。未来若能在其他工业微生物（如大肠杆菌或芽孢杆菌）中重构该途径，或通过启动子工程和蛋白工程进一步优化各组分表达比例，产量有望进一步提升。原文摘要未详述生物反应器的具体工艺参数，包括发酵时间、补料策略和溶氧控制等，这些信息对工业化放大至关重要，值得在后续研究中补充。
一个值得注意的细节是，三重突变体实验排除了其他EPS对MLG产量的竞争效应，但并未考察这些EPS是否在菌株适应性或多糖质量方面存在间接影响。此外，TolC-BgsA-BgsB复合物的原子结构尚未解析，其组装机制和底物识别方式仍待阐明。这些基础问题既是理解MLG生物合成的关键，也是理性工程化改造的前提。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology. PMID: 42552791.
PMID: 42552791