来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，受此启发，多酶级联反应被用于生产复杂分子，但实际应用中常受限于酶不相容性、底物传质差和催化剂回收困难。本研究报道了一种在Pickering乳液中运行的活体生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳液，实现反应速率较传统双相体系最高提升45倍，并支持单步、序贯及一锅法级联反应，包括克级苯偶姻合成。该平台还实现了按需双模式回收，为绿色工业生物合成提供了可持续、可放大的新方案。
研究背景
生物体内的酶级联反应将简单前体转化为复杂高值分子，其精巧之处在于多种酶被组织在特定细胞微环境中，从而克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等问题。全细胞生物催化利用工程微生物作为自我维持、自我复制的微型工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并原位提供辅因子，因而备受关注。然而，全细胞生物催化的大规模应用，尤其是涉及疏水性底物或产物的多步级联反应，仍面临重大障碍——核心挑战在于水相细胞环境与不互溶有机相之间的传质效率低下，导致反应速率缓慢；此外，许多级联反应需要生物催化剂与化学催化剂协同工作（化学酶法反应），而两者往往在不相容的条件下运行，有机溶剂的直接接触也会损害细胞活性。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，待冷却至60 °C后，通过注射方式加入2-（甲氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，再次加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。将粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤，直至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N，N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。过滤产物，旋蒸除去溶剂后，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚 = 1：3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化CD（ACD）的合成
首先，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，在冰浴中冷却至5 °C以下。随后，在对溶液进行剧烈搅拌的同时，于5分钟内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30分钟，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1小时。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），在60 °C下干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
其次，将4，7,10-三氧杂-1，13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，将所得黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集形成的沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈：H₂O：氨水 = 1：1：0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化CD（ACD）。
缀合物（cell@OBC）的制备
ⅰ）缀合物（cell@CD）的制备
将新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，在4 °C下反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，除去过量的游离ACD和未反应的试剂。离心收集产物，将最终缀合物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0，备用。
ⅱ）缀合物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液中，在4 °C下反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，除去过量的游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。然后，在乳液中加入100 mM底物以启动反应。在每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，随后用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的更多信息见Nature Portfolio Reporting Summary。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从模块化合成关键组分开始：胺化β-环糊精（ACD）主体和定制的OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度通过¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。在此基础上，研究对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行工程化改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，得到cell@CD缀合物（补充图6）。其次，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合作用自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着通过UV-Vis光谱确认——cell@OBC在330 nm处出现蒽醌部分的特征吸收峰，而天然细胞与游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果提供了稳定超分子连接的确凿证据。关键的是，研究验证了蒽醌单元的光催化活性不因其缀合到OBC结构中而受阻，为后续研究提供了极佳的起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD缀合物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）的浓度，可以精确控制细胞表面β-CD的密度，通过相应荧光强度的增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD缀合物周围出现明显的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞上无此信号，证实了β-CD主体的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的重量损失差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ-电位表征表面电荷，显示随着超分子负载量的增加，电位从天然细胞的−45 mV逐渐变化至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可以被精确调控，以适应不同的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估对胞内酶功能的影响，发现过度的表面功能化虽然增加了疏水性，但显著降低了酶的保留活性（图2f）。这一下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，在保持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健的乳化性能。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外的传质屏障，研究裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了研究假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的一个关键优势在于细胞为酶提供的保护性环境。研究假设表面修饰能进一步保护细胞免受工艺中常见的严苛条件影响。为验证这一点，研究将cell@OBC缀合物置于热和化学应激条件下。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，较未修饰的天然细胞提高了2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面——一种以诱导细胞裂解而闻名的条件——cell@OBC缀合物在两小时后仍维持52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提升了2.8倍（图3b）。其他溶剂如N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）也被用于测试，进一步巩固了聚合物对有机溶剂的保护能力（补充图12）。此外，经过2小时紫外线照射后，cell@OBC的保留活性仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色测定得到佐证，该测定可视化了cell@OBC缀合物在热和有机溶剂应激条件下相较于天然对应物的优越活力（图3d-i）。
讨论与解读
本研究通过超分子主客体化学将油基光催化剂非共价锚定于活细胞表面，成功构建了具有Pickering乳液稳定功能的“超细菌”平台。该策略的核心优势在于：表面修饰密度可通过偶联剂浓度精确调控，在保持97%以上胞内酶活性的同时赋予细胞显著增强的环境耐受性——45 °C热胁迫下活性保留69.6%（较天然细胞高2.4倍），甲苯-水界面胁迫下活性保留52.2%（高2.8倍）。研究还系统验证了该平台在单步、序贯和一锅法级联催化中的适用性，并实现了催化剂按需双模式回收。
编译者解读
该研究巧妙地将超分子化学与全细胞催化相结合，以环糊精-客体包合作用替代传统共价修饰，在保持细胞活力的前提下实现表面功能化——这种“非共价嫁接”策略在合成生物学平台开发中具有重要参考价值。其按需双模式回收设计（活细胞缀合物重复使用或合成催化剂选择性回收并重新附着于新鲜细胞）显著提升了原子经济性。值得注意的是，研究以界面催化为核心场景，将化学光催化与多酶级联整合于同一乳液体系，为水-油两相反应中生物-化学催化不兼容问题提供了可行解法。不过，该平台目前主要验证于模式酶反应，其工业规模应用的长期稳定性与复杂底物适应性仍有待进一步考察。
PMID: 42342679