来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母是合成生物学最常用的底盘细胞之一，但传统的CRISPR编辑方案往往受限于guide RNA克隆步骤的繁琐。Rostamian等人近期在《STAR Protocols》发表了一套针对酿酒酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑流程，用PCR扩增取代了限制性酶切与连接反应，将guide序列直接安装到Cas9质粒上。这一改动让guide RNA的迭代构建周期大幅缩短，为高通量编辑筛选提供了更顺畅的路径。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）长期是遗传操作的模式生物，也是工业发酵和合成生物学研究的核心平台。CRISPR-Cas9系统在酵母中的应用已有成熟框架，但多数方案在构建sgRNA表达质粒时需要依赖限制性内切酶和DNA连接酶。这种酶切-连接的克隆方式不仅步骤多、耗时长，还容易因酶切位点受限而增加设计难度。当研究人员需要同时测试多个guide RNA位点或构建guide RNA文库时，传统克隆路线就成为了明显的效率瓶颈。
针对这一问题，Rostamian等人设计了一套以PCR为基础的guide插入方案，将sgRNA序列通过PCR扩增直接整合到Cas9质粒中，同时实现质粒的无缝环化。该流程还整合了供体DNA的设计、大肠杆菌中的质粒克隆与测序验证，以及酵母的醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）共转化步骤，形成了一条从guide设计到酵母编辑株验证的完整实验链条。方案以KanMX/G418筛选标记作为质粒选择压力，便于在酵母中稳定维持Cas9-sgRNA共表达质粒。
研究方法
该协议从培养基配制开始，逐步展开完整的实验流程。原文对试剂配方和操作参数给出了详细说明。
培养基与试剂配制
LB液体培养基（含卡那霉素）的配方为：LB肉汤粉25 g/L，加入ddH₂O定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟（液体循环），冷却至约55°C后加入无菌过滤的卡那霉素储存液（50 mg/mL）至终浓度50 μg/mL（即1 mL储存液）。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存最多6个月，含卡那霉素的培养基在4°C保存最多1个月。
LB琼脂平板（含卡那霉素）的配制在LB液体培养基基础上加入Bacto琼脂15 g/L（1.5% w/v），同样121°C灭菌至少20分钟，冷却至约55°C后加入卡那霉素至终浓度50 μg/mL，轻轻旋动混匀避免产生气泡，倒入无菌培养皿，室温凝固后倒置，4°C保存最多1个月。
YPD液体培养基的配方为：葡萄糖（右旋糖）2%（w/v，10 g）、蛋白胨2%（w/v，10 g）、酵母提取物1%（w/v，5 g），ddH₂O定容至500 mL。先在约400 mL ddH₂O中溶解试剂，再用ddH₂O补足至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温保存最多6个月。
YPD琼脂平板（含G418）在YPD液体培养基基础上加入Bacto琼脂2%（w/v，10 g），灭菌后加入G418储存液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL（即5 mL储存液），配制成500 mL基础培养基加G418的体系。
guide RNA与HDR供体设计
协议详细描述了单链guide RNA（sgRNA）和同源定向修复（HDR）供体DNA的设计原则。sgRNA序列需针对目标位点进行设计，确保Cas9能够识别并切割目标序列。HDR供体则携带预期编辑序列及两侧同源臂，用于引导修复过程。原文未详述同源臂长度的具体推荐值，但强调了供体设计中应包含沉默突变以破坏PAM序列，防止编辑后Cas9再次切割。
guide插入与质粒构建
核心步骤是将PCR扩增的guide序列插入到带有KanMX/G418筛选标记的Cas9-sgRNA质粒中。与传统的限制酶切-连接法不同，该方法利用PCR产物直接完成guide序列的安装，并通过无缝环化实现质粒的重新闭合。原文未详述具体的PCR循环参数和引物设计细节。
大肠杆菌中的质粒克隆与验证
构建好的质粒被转化到大肠杆菌中，在含卡那霉素的LB培养基上进行筛选。挑取克隆后进行序列验证，确认guide序列正确插入且质粒序列无误。原文未详述转化方法（如热激或电转）及具体菌株。
酵母转化与编辑株筛选
验证正确的质粒与HDR供体DNA通过LiAc/PEG方法共转化进入酵母细胞。转化后经恢复培养，在含G418的YPD平板上进行筛选。G418（Geneticin）筛选利用了质粒上的KanMX标记，能够富集携带CRISPR质粒的酵母细胞。原文未详述LiAc/PEG转化中的具体参数（如细胞密度、PEG浓度、热激温度与时间）。
编辑验证与质粒消除
挑取酵母转化子后，使用跨越同源臂的引物进行菌落PCR（colony PCR）验证。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物。对于缺失或插入突变，PCR产物相对未编辑对照应出现条带位移；点突变则可能需要通过DNA测序进一步确认。编辑成功的克隆在非选择性培养基（YPD）中传代培养后，部分克隆会丢失KanMX标记的CRISPR质粒，可通过分别点在YPD和YPD+G418平板上进行验证——失去质粒的克隆能在YPD上生长但无法在G418平板上生长。
研究结果
转化与筛选的预期结果
LiAc/PEG转化并恢复培养后，在YPD+G418平板上进行筛选。30°C培养2–3天后，添加了HDR供体的“CRISPR + HDR donor”条件通常会产生大量菌落，而缺少供体的“no-repair（–HDR donor）”对照组仅产生极少菌落。这一“多vs少”的菌落数量对比是实验是否成功的第一项直观指标，它同时反映了两方面信息：一是转化和筛选流程是否正常运作，二是所选guide是否能在目标位点高效切割。Cas9切割本身对酵母是致死性的，如果缺乏修复模板，细胞无法存活，因此对照组的少量菌落恰恰证明了切割事件确实发生。
编辑克隆的分子验证
对6–8个菌落进行菌落PCR筛选时，使用跨越同源臂的引物进行扩增。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增条带。缺失和插入突变应相对未编辑对照显示条带位移，而点突变可能需要DNA测序来确认。在成功的实验中，至少有一部分被筛选的菌落预期为PCR阳性，跨接合位点的DNA测序应确认设计的基因型，包括供体中包含的沉默PAM破坏突变。
质粒消除与无标记编辑株获取
在非选择性培养基（YPD）中传代培养后，一部分编辑克隆会丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过将克隆分别点在YPD和YPD+G418平板上可以评估质粒丢失情况：成功消除质粒的克隆在YPD上正常生长，但在G418平板上无法生长。这一步骤为获得无标记编辑株提供了简便的验证路径，同时也表明该方案支持连续的基因编辑操作——质粒消除后可进行下一轮编辑。
讨论与展望
这套方案的价值在于把guide RNA的构建从“酶切-连接”的框架中解放出来。PCR扩增的引入不仅减少了克隆步骤，更让guide序列的迭代变得直接——研究人员只需修改PCR引物即可更换靶向位点，无需重新设计酶切策略。结合KanMX/G418筛选和HDR供体的共转化，整个流程从guide设计到编辑株验证形成了较为完整的闭环。
值得注意的是，方案的“多vs少”菌落对比设计为实验提供了内嵌的质量控制节点。如果对照组菌落数与实验组相当，则提示guide切割效率可能不佳或转化过程存在问题。这种设计让研究人员在早期阶段就能判断实验是否值得继续推进。
原文对若干关键参数（如同源臂长度、PCR循环条件、LiAc/PEG转化的具体参数）未作详细说明，实际应用时可能需要参考引用的原始文献或根据经验优化。此外，方案中使用的KanMX标记和G418筛选在工业菌株中可能受遗传背景影响，非标准实验室菌株的转化效率或许需要额外调整。总体而言，这套PCR-based guide插入方案为酵母CRISPR编辑提供了一个更简化的操作选项，尤其适用于需要并行测试多个guide位点的筛选场景。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protocols. PMID: 42519825.
PMID: 42519825