来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导语
外源基因拷贝数越高，分泌蛋白产量就越大——这条“常识”在毕赤酵母（Komagataella phaffii）中遭遇了反例。当拷贝数攀升至极端水平，内质网中的未折叠蛋白堆积反而拖垮了细胞生长，也让产量提升陷入僵局。2025年发表于Microbial Biotechnology的一项研究，从激酶敲除文库中揪出了调控未折叠蛋白响应（UPR）的PpHog1信号轴，并据此构建出高拷贝分泌适应性底盘菌株UPR-Ad+，让三种报告蛋白的产量提升了30%–46%。
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研究背景
毕赤酵母是应用最广的真核蛋白表达系统之一。提高外源基因拷贝数，向来是增强表达效率的常规策略。然而，当拷贝数高到一定程度，大量分泌蛋白前体涌入内质网，超出其折叠能力，便会诱发内质网应激（ERS）。这种应激非但不能继续增产，反而会抑制细胞生长，甚至触发未折叠蛋白响应，进一步压制外源蛋白的合成。
问题在于：高拷贝分泌表达究竟通过何种分子机制拖累细胞？UPR信号通路中哪些节点可以被工程化改造？传统上，人们聚焦于提高折叠酶或分子伴侣的表达，却忽略了应激调控网络上游的激酶级联。酿酒酵母中的Hog1 MAPK通路已知参与渗透压调控，也有零星证据提示其与ERS相关，但下游机制始终模糊。这项工作正是从这一空白切入，试图在毕赤酵母中厘清UPR的调控节点，并以此为靶点构建抗应激底盘。
研究方法
研究人员首先构建了一系列携带不同人血清白蛋白（HSA）拷贝数的毕赤酵母菌株，分别用于胞内表达和分泌表达。菌株命名规则为“GS-拷贝数×”，带α表示分泌表达，不带α表示胞内表达。通过点板实验（spot assay）评估这些菌株在YPD平板和甲醇诱导条件下的生长适应性。
随后，团队对激酶敲除文库进行筛选，以鉴定调控UPR信号的激酶。RT-qPCR被用于比较野生型菌株（GS115，±DTT处理）和高拷贝分泌菌株（GS-25×αHSA）中已知UPR基因的表达水平。差异分析以p值标注显著性：p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。
为解析PpHog1的下游调控网络，研究人员对比了DTT处理与未处理条件下PpHog1的互作组（interactome），并结合遗传敲除/敲低筛选，锁定关键UPR调控因子。最终，通过过表达三个关键调控因子，构建了工程化UPR适应性底盘菌株UPR-Ad+。
验证实验中，以人血清白蛋白（HSA）、人钙调节肌动蛋白结合蛋白LCP1和α-淀粉酶作为报告蛋白，检测UPR-Ad+菌株在高拷贝分泌表达条件下的产量提升幅度。
原文摘要未详述激酶敲除文库的具体构建方法、DTT处理浓度与时间、互作组鉴定技术平台（如是否采用免疫沉淀-质谱联用）等具体参数。RT-qPCR的具体引物序列、内参基因选择、反应程序等细节也未在摘要中披露。
研究结果
高拷贝分泌表达显著损害细胞生长适应性。 点板实验显示，在YPD平板（HSA不表达）上，所有菌株生长状况相当。但改用甲醇诱导HSA表达后，分泌表达菌株出现严重生长缺陷，且缺陷程度随HSA拷贝数升高而呈明显剂量依赖性加重。与之形成鲜明对比的是，胞内表达菌株即便携带最高拷贝数，在相同诱导条件下仍保持健壮生长。
这一生长代价与内质网腔拥堵直接相关，而非外源蛋白本身的毒性。RT-qPCR分析揭示了更深层的机制：10–17拷贝数的分泌表达菌株中，HSA mRNA水平反而显著低于4–7拷贝数的胞内表达菌株。这种反直觉的现象表明，内质网应激会主动抑制全局转录，作为反馈机制减少进入内质网的蛋白负荷。
PpHog1 MAPK通路调控UPR信号。 激酶敲除文库筛选确认，毕赤酵母的UPR信号受PpHog1介导的MAPK通路调控。PpHog1是酿酒酵母Hog1（ScHog1）的同源蛋白，序列一致性达67%。ScHog1传统上被认为参与渗透压应激和细胞壁完整性调控，尽管也有研究提示其涉足ERS调节，但下游通路始终不明。
两个关键UPR调控因子被鉴定。 通过比较DTT处理与未处理条件下PpHog1的互作组，结合后续遗传敲除/敲低筛选，研究人员鉴定出两个关键UPR调控因子：PpLRR-0498和PpINT-0120。这两个因子与PpHog1共同构成UPR调控网络的核心节点。
UPR-Ad+底盘菌株验证成功。 通过过表达PpHog1、PpLRR-0498和PpINT-0120这三个关键调控因子，工程化菌株UPR-Ad+在三种报告蛋白的高拷贝分泌表达中均展现出增产效果：人血清白蛋白、人LCP1和α-淀粉酶的产量提升幅度为30%–46%。这一提升幅度覆盖了不同分子量、不同折叠复杂度的分泌蛋白，提示该底盘具有较好的通用性。
讨论与展望
这项工作的价值在于把UPR调控从“被动补救”转向“主动适应”。传统策略试图通过过表达折叠酶来缓解内质网压力，而本研究证明，调控应激信号通路上游的激酶节点同样有效——甚至可能更根本，因为它直接改变细胞对蛋白负荷的感知阈值。PpHog1在毕赤酵母中同时掌管渗透压、细胞壁完整性和UPR三条通路，这种多效性意味着工程化改造必须谨慎权衡：增强UPR适应性的同时，是否会削弱菌株在高渗环境下的耐受性？摘要未提供相关数据，但这无疑是实际应用中需要回答的问题。
30%–46%的产量提升幅度，在高拷贝背景下已属可观。值得注意的是，该策略并未依赖密码子优化或启动子强化等常规表达工程手段，而是从宿主应激生理入手，为高产菌株设计提供了差异化路径。未来若能解析PpLRR-0498和PpINT-0120的分子功能细节，或将解锁更精准的调控靶点。
参考来源
Shi J, Lv Z, Lu C, Fang B, Zou Z. Harnessing the PpHog1 Regulatory Network to Engineer a UPR-Adaptive Komagataella phaffii Chassis for High-Copy Secretory Protein Production. Microbial Biotechnology, 2025. PMID: 42427095.
PMID: 42427095