来源：Sci Rep | 编译：DNA Lab Space
导读
银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性在活性包装和伤口敷料领域备受关注。本研究从家庭自制醋中分离的醋杆菌和驹形杆菌发酵废液中，以3 mM硝酸银为前体，在50°C黑暗条件下成功生物合成AgNPs。紫外-可见光谱在414–432 nm处出现特征性表面等离子体共振峰，SEM显示颗粒呈球形，直径20–100 nm。研究系统评估了六种菌株合成AgNPs的理化性质、抗氧化、抗菌及细胞毒性，并初步探索了其在食品包装膜中的应用潜力。
研究背景
纳米科技在医学、环境和农业领域引发革命性进展，纳米材料至少一维尺寸在1–100 nm之间，凭借小尺寸赋予的高比表面积和独特功能特性，在生物系统交互中展现优势。银纳米颗粒作为应用最广泛的金属纳米颗粒之一，具有抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化等特性，适用于伤口愈合材料、生物传感器、药物递送系统和食品包装等领域。
然而，物理和化学法合成金属纳米颗粒常涉及有毒化学品、高能耗并产生环境有害废物。相比之下，微生物介导的“绿色合成”利用环境友好试剂、产生较少有毒废物，日益受到重视。微生物作为纳米颗粒合成的有效生物催化剂，其产生的生物分子可作为天然稳定剂，减少颗粒聚集并提高稳定性。细菌纳米颗粒生物合成可通过胞内和胞外两种途径进行。
研究方法
细菌来源与保存
用于AgNPs生产的醋酸菌分离自家制醋，被鉴定为纤维素酶产生菌。菌株来自奥ndokuz Mayıs大学Karadeniz先进技术研究与应用中心的−80°C冰箱保存物。细菌在Hestrin-Schramm（HS）琼脂培养基（5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、1.15 g/L柠檬酸、2.7 g/L Na₂PO₄、15 g/L琼脂）上培养以确认纯度。整个研究期间细菌保存于4°C。
AgNP生产菌株筛选
分离菌株在HS肉汤中于30°C培养21天以进行细菌纤维素生产。培养后，小心去除培养物表面形成的纤维素膜。剩余培养液以10,000 × g离心10分钟，随后过滤获得无细胞上清液。该上清液代表细菌纤维素生产过程中产生的液体废物，用作银纳米颗粒合成的反应介质。对于AgNP生产，将培养上清液与AgNO₃溶液混合，使最终AgNO₃浓度为3 mM。反应混合物在50°C黑暗条件下孵育48小时。通过紫外-可见分光光度法监测表面等离子体共振确认银纳米颗粒的形成。
基于16S rRNA基因的菌株鉴定
提取DNA用于醋酸菌表征，使用Genomic DNA Purification GeneJET Kit进行DNA分离。16S核糖体DNA片段经聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用27正向引物（5‘-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492反向引物（5‘-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’），按照试剂盒程序操作。反应使用Thermo Scientific DreamTaq DNA聚合酶。PCR混合物包含：4 µL基因组DNA、5 µL 10×缓冲液混合物、1 µL脱氧核苷三磷酸、3 µL各引物混合物、0.25 µL DreamTaq（Thermo Scientific）和33.75 µL无核酸酶水。初始变性95°C 3分钟后，反应运行40个循环：95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 1分钟，随后72°C最终延伸15分钟。方案使用Genepro热循环仪（中国，Bioer Technology）TC-E-96G型号执行。
琼脂糖凝胶电泳在90 V下运行90分钟以评估PCR产物的大小和完整性。在含10 µL/mL EtBr的1%琼脂糖凝胶上，通过Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）可视化DNA条带。PCR产物经分光光度法测定密度和纯度（A260/A280），用SeqLine CleanSEQ Kit纯化，然后通过ABI 3130遗传分析仪（Applied Biosystems）进行双向测序。使用Chromas程序（Technelysium Pty. Ltd.）检查正反向引物获得的DNA序列质量，并通过BioEdit程序组装。随后将序列与EzBioCloud 16S数据库（https://www.ezbiocloud.net/）中的16S rRNA基因序列进行比较。最后，使用MEGA 6程序通过邻接法构建菌株系统发育树。
AgNPs的生产与回收
首先，将AgNO₃加入从21天细菌培养物（HS肉汤，30°C，150 rpm振荡条件）中离心（10,000 × g，10分钟）分离的上清液中，使终浓度为3 mM。反应混合物在50°C黑暗条件下孵育48小时，然后离心（13,000–15,000 × g，30分钟）沉淀合成的AgNPs。随后，AgNPs用超纯水洗涤，在50°C无水烘箱中干燥，最后避光保存备用。
AgNPs的理化表征
扫描电子显微镜（SEM）和EDS mapping成像：微观结构表征
将适量AgNP粉末置于0.5 cm²玻璃载玻片上，使用JEOL JSM-7001F场发射扫描电子显微镜（FESEM）在15 kV下分析样品。使用FESEM内置的X-Max 80 mm²检测器（Oxford Instruments，英国）在同一载玻片上进行EDS mapping。
衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
干燥AgNPs的ATR-FTIR分析使用PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR光谱仪（德国）在400–4000 cm⁻¹范围内进行，分辨率为4 cm⁻¹。分析前，合成的AgNPs离心并用蒸馏水多次洗涤以去除未结合的生物分子和残留杂质，然后在室温下干燥。少量干燥的纳米颗粒粉末直接置于ATR晶体表面，无需进一步制备。通过平均多次扫描记录光谱以提高信噪比。获得的光谱用于鉴定与AgNPs还原和稳定相关的生物分子官能团。特别分析了对应于O–H、C=O、C–O和N–H官能团的特征吸收带，以评估蛋白质、多糖或其他有机化合物在纳米颗粒合成和包覆中的参与。
X射线衍射（XRD）分析
合成的AgNPs晶体结构通过XRD分析确定，使用Rigaku SmartLab衍射仪（Rigaku SmartLab Beijing Co.，中国），配备Cu Kα辐射（λ = 1.5406 Å）和Cu Kβ滤光片。AgNP粉末样品在分析前干燥并细磨以确保均匀性。衍射图谱在2θ范围10–80°内记录，扫描速率2°/min，操作条件为40 kV和30 mA，连续扫描模式。获得的衍射峰与标准粉末衍射联合委员会（JCPDS）数据比对，确认银的面心立方（FCC）晶体结构。对应于（111）、（200）、（220）和（311）晶面的特征衍射峰用于验证晶体AgNPs的形成。此外，使用Debye–Scherrer方程基于最强衍射峰的半高全宽（FWHM）估算平均晶粒尺寸。
动态光散射（DLS）和Zeta电位（ζ）
AgNPs在超纯水中的尺寸分布、平均直径和Zeta电位（折射率：1.330，粘度：0.8872）使用Zetasizer Nano ZS（Malvern Panalytical，英国）在25°C下分析。2 mL AgNPs悬浮液（1 mg/mL）置于石英比色皿中，激光照射后分析散射光波动，通过布朗运动确定颗粒尺寸。
抗菌活性分析
测试的多种微生物（包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌）通常与食品污染、腐败或食源性感染相关。因此，选择这些微生物评估合成的AgNPs在食品保鲜和活性包装系统中的潜在适用性。革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌（ATCC 43300—耐甲氧西林）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923—甲氧西林敏感）、蜡状芽孢杆菌（NTCC 7464）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）和粪肠球菌（ATCC 29212）。
研究结果
菌株供应、AgNP生产与表征
从Samsun省生产的家庭自制醋中分离的醋酸菌中，鉴定出适合银纳米颗粒（AgNP）生产的菌株。反应混合物从浅黄色到红棕色的视觉变化是判断适宜性的基础，UV-Vis光谱分析验证了这一变化。此外，光谱中代表表面等离子体共振（SPR）振动的特征峰出现以及350–450 nm范围内的吸收峰确认了AgNPs的合成。如图1所示，可以从苹果醋（1A、1B、3A）、无花果醋（2B、2D）和梨醋（X1）中分离的细菌培养上清液合成AgNPs。
银纳米颗粒的理化特性可从SPR峰推断。SPR峰随AgNP尺寸减小而向较短波长移动。此外，SPR峰强度随悬浮液中纳米颗粒浓度增加而增强。SPR光谱中观察到的吸收带宽度指示颗粒尺寸分布：宽谱带反映多尺寸分布，而窄谱带表示均匀分布，即单尺寸分布。据此，从分离株1A、1B、3A和2B培养上清液合成的AgNPs直径更小，分布比从分离株2D和X1合成的更均匀。这表明这些分离株的代谢物谱在形成过程中更有效地控制了AgNPs的尺寸。结论是所有合成AgNPs的浓度处于相似水平。这一发现揭示了尽管颗粒尺寸和分布存在差异，各分离株的总纳米颗粒合成产量基本保持。此外，培养上清液在纳米颗粒特征区域未表现出明显吸收峰，AgNO₃溶液同样未显示SPR相关吸收。
从分离株获得的16S rRNA基因序列使用EzBioCloud平台分析并与数据库记录比较。序列经比对，使用邻接法构建系统发育树（图2）。据此，分离株1A、1B、3A、2B和2D属于同一单系群，自举值高（93–97%）。此外，这些分离株与巴氏醋杆菌、A. oryzoeni、A. ascendens和A. oryzifermentans等物种密切相关。考虑到核苷酸相似性，确定它们在系统发育上与巴氏醋杆菌更接近。另一方面，分离株X1与驹形杆菌属物种聚类，与中间驹形杆菌和Komagataebacter medellinensis密切相关。细菌的编号、属和登录号显示在表1中，来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI）。登录号（PV341489–PV341662）确认序列已存入NCBI数据库，确保了分类鉴定结果的可追溯性和可重复性。醋杆菌属和驹形杆菌属的存在尤为重要，因为这些类群的成员以细菌纤维素生产能力著称，支持了它们被选用于后续纳米颗粒合成实验的合理性。
合成AgNPs的理化表征
AgNPs的微观表征（电子显微镜）结果
图3显示了从六个不同醋源分离的细菌菌株培养上清液合成的AgNPs的SEM图像。SEM研究揭示了合成纳米颗粒在尺寸和分布上的菌株特异性差异，确认可以从所有分离株的培养上清液生产AgNPs。从醋杆菌属1B、2D和3A培养上清液合成的AgNPs直径分别为20–40 nm、30–60 nm和30–70 nm，且比其他合成纳米颗粒分布更均匀。从醋杆菌属1A和驹形杆菌属X1培养上清液合成的AgNPs（A1A-AgNPs和KX1-AgNPs）呈球形，尺寸范围30–100 nm，但形态相对不规则。另一方面，用醋杆菌属2B培养上清液合成的AgNPs（A2B-AgNPs）呈棒状并发生团聚。
表2中的EDS图谱显示AgNP结构具有相同组分。Ag占比46–93%，这符合预期，因为它是银纳米颗粒的主要成分。碳、氮和氧各自质量占比高达20%。表面的有机化合物可能表明存在还原/包覆剂。P、S和Cl（<4%）来自生物分子或合成环境。Na和Al以痕量存在，被认为是污染物或缓冲盐。据报道，在植物基合成中，EDS分析观察到Ag旁边存在高比例的C、N和O。另有研究报道银纳米颗粒周围的酚类涂层在EDS中显示为C和O。根据相关研究，蛋白质包覆的银纳米颗粒元素分析揭示了AgNP周围蛋白质层特征性的氮和磷信号。
讨论与解读
本研究利用醋杆菌生产细菌纤维素过程中产生的液体废物，建立了一种新颖且可持续的AgNPs绿色合成方法。合成的AgNPs通过XRD、SEM和FTIR分析成功表征，确认了球形形态和晶体结构。生物学评估显示，某些纳米颗粒变体（特别是KX1-AgNPs和A2B-AgNPs）表现出抗氧化和抗菌活性，并对细胞活力产生浓度依赖性细胞毒性效应。DLS和Zeta电位分析进一步支持了生物合成纳米颗粒的功能稳定性和适用性。DLS测量的流体动力学直径（85–179 nm）和PDI值（0.274–0.402）表明纳米颗粒群体呈中等单分散至异质分布。
随着基于AgNP的活性包装系统日益普及，必须仔细考虑银离子或纳米颗粒向食品基质中潜在迁移的问题。确实，一些研究表明这种迁移可能引起毒理学效应。因此，未来的研究必须包括全面的安全性评估，以确保含AgNP的材料可以在与食品接触的应用中安全、负责任地使用。
编译者解读
该研究亮点在于将细菌纤维素生产的废弃液“变废为宝”，以废液中的天然代谢物同时充当还原剂和稳定剂，省去了传统化学合成中额外添加表面活性剂的步骤。六株菌株产出的AgNPs在粒径、形貌和活性上呈现菌株依赖性差异，提示筛选高效菌株是优化绿色合成路径的关键杠杆。KX1-AgNPs的DPPH清除率达56.01%，抗菌最低抑菌浓度可达16 µg/mL（ESBL阳性大肠杆菌），展示了实际应用潜力。但需注意，AgNPs在高浓度下对成纤维细胞的毒性提示食品包装应用前必须系统评估银离子迁移风险——这既是挑战，也是该领域未来研究的核心方向。
PMID: 42129258