来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
多糖是自然界中结构最复杂、功能最多样的生物大分子之一。混合连接β-葡聚糖（Mixed-linkage β-glucan，MLG）因其独特的流变学特性和结构特征，正成为生物技术领域备受关注的新型生物聚合物。然而，MLG生物合成机制的全貌尚未完全揭开，高效生产策略也仍在探索之中。一项发表于《Microbial Biotechnology》的最新研究，揭示了外膜蛋白TolC在MLG合成中的关键作用——它不仅是合成机器的核心组件，更成为工程化改造的突破口，使MLG产量在生物反应器条件下达到约10 g/L。
研究背景
MLG是一类由β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的葡聚糖，广泛存在于谷物细胞壁和某些细菌的胞外多糖中。在根瘤菌中，MLG的合成受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控，由双顺反子操纵子bgsBA介导。过去的研究已鉴定出BgsA（糖基转移酶）和BgsB（推测为膜相关蛋白）两个关键组分，但完整合成机器的组成以及如何实现高效生产，始终是悬而未决的问题。
TolC是革兰氏阴性菌中一种典型的外膜蛋白，通常参与多药外排和蛋白分泌系统。它是否与MLG合成有关，此前从未被报道。本研究以苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）为模式菌株，系统探究TolC在MLG生物合成中的功能，并基于此开发了高产工程菌株。
研究方法
菌株与培养条件
研究使用了多种根瘤菌菌株，包括S. meliloti、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）和菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）。这些菌株常规培养于补充有3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY）或最低培养基（MM）中。MM培养基每升含：10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃和0.05 g NaCl，另添加1 mL 1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素和0.1 g/L泛酸钠）。
S. meliloti和M. japonicum菌株在28°C下培养，R. etli菌株则在30°C下培养。用于克隆和接合的E. coli菌株在37°C的LB培养基中培养。抗生素使用浓度如下：四环素（Tc）10 μg/mL（R. etli中为5 μg/mL）、卡那霉素（Km）50 μg/mL、刚果红（CR）50 μg/mL、荧光增白剂（Calcofluor White，CF）200 μg/mL、IPTG 1 mM。所有质粒均通过E. coli β2163或S17.1供体菌株接合转移进入根瘤菌。
MLG产量测定
MLG产量通过地衣多糖酶（lichenase）消化后释放的葡萄糖当量进行定量，具体方法参照Marchante等人（2024）的流程。根瘤菌在含100 mL三角瓶中培养，每瓶装20 mL补充有适当浓度Tc的液体MM培养基。S. meliloti菌株在28°C、R. etli菌株在30°C下，以170 rpm振荡培养3天。初始OD600调节至0.05。
三突变体构建
为探究其他c-di-GMP调控的胞外多糖对MLG产量的影响，研究构建了三重突变体IBR606，同时缺失EPS II、EPS I和APS三种多糖的合成基因。具体而言，对wgcA（EPS II合成）、exoY（EPS I合成）和uxs1-uxe（APS合成）三个基因进行了框内缺失。突变依次引入，并通过PCR和表型分析双重确认。构建完成后，将IBR606的MLG产量与野生型进行比较。
过表达模块构建
为提升MLG产量，研究将tolC、bgsBA和组成型活性双鸟苷酸环化酶基因pleD***共同过表达。其中，pJBpleD质粒通过表达组成型活性的双鸟苷酸环化酶来提高胞内c-di-GMP水平。对照组使用不含tolC的质粒。
研究结果
三重突变体对MLG产量无显著影响
在生理c-di-GMP水平下，野生型S. meliloti 8530的MLG产量低于检测限。三重突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）的MLG产量与野生型相比无显著增加。当引入pJBpleD质粒后，IBR606的MLG产量得到提升，略高于野生型，但差异未达到统计学显著水平。这一结果表明，S. meliloti*合成其他c-di-GMP调控的胞外多糖（EPS I、EPS II和APS）的能力对MLG产量没有重大影响。
TolC是MLG合成的必需因子
研究中最重要的发现是：tolC基因的遗传破坏完全消除了MLG合成，而回补（complementation）则恢复了MLG生产能力。这一结果清晰地表明，外膜蛋白TolC是S. meliloti中MLG生产不可或缺的组分。作者提出，TolC与BgsA和BgsB共同构成一个三组分复合物，实现聚合物的高效合成和/或分泌。
共过表达实现8倍产量提升
将tolC、bgsBA和pleD***共过表达后，MLG产量较不含tolC*的对照质粒提升了8倍。在生物反应器条件下，MLG产量达到约10 g/L。这一数据有力地证明了TolC在MLG生物合成中的核心作用，也展示了该遗传模块在规模化生产中的巨大潜力。
模块可移植性验证
该遗传模块不仅适用于S. meliloti，还能在原本不产生MLG的根瘤菌宿主中实现从头合成。研究者将包含tolC、bgsBA和pleD***的模块导入M. japonicum*，成功实现了MLG的异源生产。这证明了该模块的可移植性，为细菌底盘更换和合成生物学应用提供了可能。
讨论与展望
这项研究有几个值得深思的亮点。TolC作为外膜蛋白，以往的功能认知多集中在药物外排和毒素分泌上，本研究将其与MLG合成直接挂钩，拓展了TolC的功能谱系。三组分复合物的提出也颇具巧思——BgsA负责糖链延伸，BgsB可能锚定在细胞膜上，TolC则在外膜侧提供通道，三者协作完成MLG的合成与分泌。
从应用角度看，8倍产量提升和约10 g/L的产量数据相当亮眼。更关键的是模块的可移植性——能在异源宿主中实现MLG从头合成，意味着未来可以根据不同宿主的特点优化生产策略。比如，M. japonicum生长速度快、遗传操作便利，可能成为MLG生产的优选底盘。
当然，这项研究还有进一步深化的空间。TolC与BgsA、BgsB之间的具体互作机制、三组分复合物的组装方式、以及MLG分泌的分子细节，都是值得追问的问题。原文摘要未详述这些层面的实验细节。另外，10 g/L是在生物反应器条件下的产量，摇瓶条件下的产量数据原文摘要未提供，两者之间的差距也暗示了发酵工艺优化的潜力。
MLG作为一种可再生的生物聚合物，在食品、医药和材料领域都有广阔的应用前景。这项研究不仅补全了MLG合成机器的最后一块拼图，更为其规模化生产提供了切实可行的工程策略。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology. PMID: 42552791.
PMID: 42552791