核桃等坚果中黄曲霉毒素与杂色曲霉素的UHPLC-MS/MS检测

来源：Mycotoxin Res | 编译：DNA Lab Space

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导读

坚果营养丰富，却易被产毒真菌污染。本研究对五种市售坚果进行表面消毒后接种不同黄曲霉菌株，利用UHPLC-MS/MS结合稳定同位素稀释分析法定量检测黄曲霉毒素B1、B2和杂色曲霉素。结果显示毒素产生高度依赖菌株，且核桃对黄曲霉毒素积累表现出显著高于其他坚果的敏感性，为气候变化背景下坚果食品安全风险评估提供了关键数据。

研究背景

坚果在全球范围内被广泛消费，因其富含蛋白质、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质而被视为营养密度最高的食物之一。虽然从植物学角度，腰果仁、开心果和花生并非真正的坚果，但日常语言中"坚果"一词被广泛使用，本文统一使用该术语涵盖所研究的全部基质。

坚果产业在德国市场的重要性持续上升：2018年德国树坚果种植面积仅600公顷，2024年已增至1600公顷；2024/25年度坚果和干果消费量达48.2万吨；2024年德国坚果市场销售额约30.4亿欧元，预计2030年将增至近39亿欧元。

树坚果易被多种真菌定殖，导致变质并产生有毒次生代谢物。其中，产毒曲霉属真菌因能产生具有肝毒性的黄曲霉毒素而尤为令人担忧。本研究旨在通过受控实验，系统比较不同坚果基质对黄曲霉菌生长及毒素产生的影响。

研究方法

化学试剂

LC-MS级乙腈和甲醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）；LC-MS级超纯水由Th. Geyer（德国雷宁根）提供。氯化钠购自Avantor（前VWR Darmstadt，德国），无水硫酸镁、甲酸、氨水溶液和甲酸铵溶液购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆），纯度均为分析级或更高。分散固相萃取净化管使用Supel™ QuE PSA（伯胺/十八烷基硅烷）管，含400 mg Discovery™ DSC-18、1200 mg无水MgSO₄和400 mg Supelclean™ PSA，购自Sigma-Aldrich。Oxoid™林格氏液片剂购自Thermo Fisher Scientific（德国达姆施塔特），Tween® 80购自Sigma-Aldrich Canada Co（加拿大安大略），麦芽提取琼脂购自Millipore（加拿大安大略），乙醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）。

样品

去壳但未经其他处理的核桃、腰果、榛子、花生和开心果样品购自德国市场，在室温避光条件下储存至进一步处理。

分析标准品

乙腈中混合黄曲霉毒素溶液（AFG1、AFG2、AFB1和AFB2各1 µg/mL）及未标记杂色曲霉素购自Romer Labs（前Biopure，奥地利图尔恩）。标记标准品[¹³C₁₇]AFG1、[¹³C₁₇]AFG2、[¹³C₁₇]AFB1、[¹³C₁₇]AFB2和[¹³C₁₈]STC由Fianovis（前Libios，法国Vindry-sur-Turdine）提供。

储备液配制

将购得的标记和未标记毒素储备液用乙腈进一步稀释，得到0.1、0.01和0.001 µg/mL的工作浓度。所有溶液储存于-28 °C。

黄曲霉菌株

为覆盖菌株间差异，选取5株产毒能力不同或尚未表征的黄曲霉菌株：DSM 1959、NRRL 3357、AF 70、CBS 119.62和NRRL 1957，依据机构可用性确定。所有黄曲霉菌株在慕尼黑工业大学微生物学教席的麦芽提取琼脂上培养。

黄曲霉接种

孢子悬浮液制备

黄曲霉菌株在麦芽提取琼脂上培养以获取孢子，用无菌林格-Tween溶液（25%（w/v）林格液于水中，0.1% Tween（v/v））收获孢子。孢子悬浮液浓度通过将系列稀释液涂布于麦芽提取琼脂并计数菌落确定。随后用林格-Tween溶液将孢子悬浮液调整至约1×10⁵孢子/mL，并通过重新涂布和菌落计数验证。孢子悬浮液制备方法改编自弗劳恩霍夫过程工程与包装研究所的方案。

表面消毒

表面消毒使用95%乙醇，参照Amini等（2016）的方法。坚果仁浸入乙醇/水溶液（95:5，v/v）中，在层流罩（BDK，德国Sonnenbühl-Genkingen）内室温干燥过夜。随后将坚果放入配有含0.2 μm孔径DURAN®膜盖的无菌实验室烧瓶中。表面消毒效果在预实验中评估：取10 g核桃，用5 mL林格-Tween溶液洗脱微生物组，随后涂布于麦芽提取琼脂。预实验确认了95%乙醇对核桃仁表面消毒的有效性。选择该表面消毒方法是为了尽量减少对样品材料的改变，否则可能影响真菌生长和黄曲霉毒素生成潜力，尤其要避免高压灭菌导致的热变化。

接种

接种以双份重复进行。核桃样品接种所有不同黄曲霉菌株，而腰果、榛子、花生和开心果样品仅接种AF 70和CBS 119.62菌株。对照样品用无菌林格-Tween溶液代替孢子悬浮液处理。接种条件参照Assunção等（2015）描述的方案，在30 °C、95%相对湿度下培养20天，生物学重复两份。100 g表面消毒的坚果仁与相当于仁质量2%（w/w）的孢子悬浮液混合，然后在气候箱（Climacell EVO，MMM Group，德国慕尼黑）中按指定条件培养。

孢子灭活

孢子灭活基于黄曲霉孢子的热敏感性（Zhang等，2018）。接种实验结束后，样品立即在55 °C干燥90 min，以实现完全孢子灭活。

研磨

每个样品随后用实验室研磨机（Grindomix GM 200，Retsch GmbH，德国哈恩）研磨，储存于-28 °C直至进一步样品制备。

水分含量

样品水分含量通过红外干燥法使用水分分析仪（Kern & SOHN GmbH，德国巴林根-弗罗默恩）测定。取2.5 g均质化样品在120 °C下干燥至恒重，根据记录的质量损失计算水分含量。

真菌毒素提取

所有样品（未处理坚果、表面消毒坚果、对照和接种坚果）的样品制备均按Schneidemann-Bostelmann等（2026）的方案进行，三次重复。所有细节汇总于补充信息（补充表1）。

方法验证

所用方法已根据Vogelgesang和Hädrich（1998）的方案完成验证（Schneidemann-Bostelmann等，2026），验证结果汇总于补充信息（补充表2）。

校准与定量

所有分析物通过稳定同位素稀释分析法进行定量。校准曲线通过将固定量的稳定同位素标记内标与不同浓度的相应未标记分析物混合制备，得到n(A)/n(IS)摩尔比在0.01至100之间（1:100、1:50、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1）。将色谱峰面积比[A(A)/A(IS)]对相应摩尔比[n(A)/n(IS)]作图构建校准函数。采用线性回归获得响应曲线，线性通过Mandel拟合检验（Mandel，1964）验证。

UHPLC-MS/MS分析

UHPLC-MS/MS测量以Dick等（2024）和Schneidemann-Bostelmann等（2026）先前描述的方法为基础，但移除了除AFs和STC之外的所有分析物，因它们与本 study 无关。色谱分离使用Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统（Shimadzu，日本京都）。采用Waters BEH C18 UHPLC色谱柱（Acquity BEH C18，100 mm，1.7 μm × 2.1 mm；Waters GmbH，德国埃施博恩），柱温40 °C。流动相流速设为0.3 mL/min。二元梯度由溶剂A（5 mM甲酸铵水溶液，用25% NH₄OH溶液调至pH 9）和溶剂B（甲醇）组成。梯度程序起始于5% B保持2 min，1 min内升至18% B，随后2 min内逐渐升至25%，之后8 min内升至90%，0.5 min内进一步升至99%并保持2 min，随后3.5 min内回到5% B，再平衡5 min。进样体积原文未详述。

研究结果

不同坚果类型中检测到的真菌毒素水平综合数据（包括AFB1、AFB2和STC）见图5和图6。精确浓度列于补充信息（补充表4–7）。对照及接种AF70和CBS 119.62菌株的坚果图像见补充信息（补充图1–22）。

不同菌株接种后核桃中黄曲霉和杂色曲霉毒素的产生

对接种不同黄曲霉菌株的核桃中AFs和STC的定量分析揭示了AFB1、AFB2和STC产生的高度菌株依赖性，而所有样品中均未检出AFG1和AFG2。这一观察与黄曲霉已知的生物合成能力高度一致——黄曲霉产生B型AFs和STC但不产生G型AFs（Ráduly等，2020）。因此可以认为接种成功且未发生与其他曲霉属物种的交叉污染。未处理的核桃未检出AFs或STC，表面消毒样品同样未检出。两份对照样品中有一份检出低水平AFB1（0.18 ± 0.09 µg/kg），且该样品呈现可见真菌污染。虽然菌丝体表型外观类似曲霉属，但未进行分类学确认。鉴于核桃产自德国——该地区黄曲霉或寄生曲霉的自然污染在生态学上极不可能——且消毒方案已在预实验中验证，该单一实例最可能代表二次实验室污染而非原料的基线定殖。

考察各黄曲霉菌株时发现，几乎所有菌株都能产生AFB1。此处AFB1浓度增加特指初始未接种基质的基线水平与培养后检出水平之间的差异。在α = 0.05显著性水平下，AF70菌株接种样品（1494 ± 180 µg/kg和超过11,000 µg/kg）、CBS119.62菌株接种样品（0.30 ± 0.02 µg/kg和23.4 ± 4.95 µg/kg）、NRRL 1957菌株接种样品（0.18 ± 0.09 µg/kg和0.95 ± 0.02 µg/kg）以及NRRL 3357菌株接种样品（569 ± 82.6 µg/kg和151 ± 1.31 µg/kg）中AFB1浓度均显著增加。只有DSM 1959菌株无法在核桃上产生AFB1。AFB2和STC仅在AF70菌株（AFB2：147 ± 13.6 µg/kg和1,411 ± 298 µg/kg；STC：60.2 ± 2.17 µg/kg和262 ± 36.1 µg/kg）、NRRL 3357菌株（AFB2：76.8 ± 3.92 µg/kg和9.51 ± 0.86 µg/kg；STC：4.00 ± 0.06 µg/kg和1.29 ± 0.20 µg/kg）以及CBS 119.62的一个生物学重复（AFB2：3.58 ± 0.38 µg/kg；STC：0.26 ± 0.04 µg/kg）中显著产生。然而，由于NRRL 3357菌株的菌丝生长明显强于AF70和CBS 119.62，我们决定用AF70和CBS 119.62接种其他坚果品种。这一选择主要出于安全考虑，以尽量减少后续样品均质化过程中的粉尘形成和孢子气溶胶化的潜在风险，从而降低生物安全风险。生物学重复之间观察到的差异可用潜在的热点效应解释——若重复中单颗坚果的毒素浓度高于其他坚果，接种后均质化可能导致样品总AF水平升高。

AF70和CBS119.62菌株接种后核桃、榛子、腰果、开心果和花生中AF和STC的产生

与核桃中观察到的情况一致，腰果、开心果、榛子和花生中仅检出B型AFs和STC而未检出G型AFs，表明黄曲霉接种成功且无交叉污染。未处理的榛子和腰果不含AFB1、AFB2和STC，而开心果原料含有AFB1（0.76 ± 0.11 µg/kg）、AFB2（0.35 ± 0.06 µg/kg）和STC（0.22 ± 0.01 µg/kg）。花生原料受STC污染（0.25 ± 0.01 µg/kg）。

考察用于接种不同坚果基质的两个菌株时发现，AF70菌株能在除开心果外的所有坚果上产生AFB1，且与各自原料相比，AFB1浓度在α = 0.05显著性水平下显著增加（腰果：0.11 ± 0.01 µg/kg和0.16 ± 0.02 µg/kg；榛子：0.11 ± 0.01 µg/kg和3.56 ± 0.90 µg/kg；花生：0.16 ± 0.05 µg/kg和17.9 ± 8.27 µg/kg）。AF70菌株接种导致腰果中AFB2浓度升高（两份样品均在LOD和LOQ之间）、花生中升高（5.43 ± 0.94 µg/kg和6.54 ± 1.19 µg/kg）以及接种榛子的一个生物学重复中升高（0.18 ± 0.02 µg/kg），而STC形成仅在花生的一个生物学重复（5.28 ± 0.18 µg/kg）和榛子的一个生物学重复（0.08 ± 0.02 µg/kg）中观察到。在开心果上，该黄曲霉菌株未产生任何AFs或STC。与核桃上的毒素形成相比，该菌株在核桃上产生的AFB1、AFB2和STC浓度明显高于其他受检坚果。

CBS119.62菌株仅在花生的一个生物学重复中产生AFB1（0.06 ± 0.01 µg/kg），在花生中产生AFB2（7.59 ± 1.13 µg/kg和0.26 ± 0.04 µg/kg）以及榛子的一个生物学重复中产生AFB2（0.13 ± 0.03 µg/kg）。与在核桃上的行为不同，该菌株未在任何其他受检坚果上产生STC。黄曲霉菌株CBS 119.62无法在开心果上产生AFs或STC。如核桃部分所述，其他坚果也应考虑热点效应的可能性，因为单颗受污染坚果可导致个别样品中AF水平升高。

不同坚果基质上AF和STC形成的比较及文献数据

比较不同坚果基质上的AF形成可知，受检黄曲霉菌株在核桃上产生的B型AFs和STC浓度显著高于其他坚果。这与Molyneux等（2007）的发现形成对比——该研究报道了核桃中没食子酸和其他抗氧化化合物具有抑制AF的特性。然而他们也指出，这些化合物必须存在于种皮中而非胚乳中，因为不含种皮的果仁材料未表现出抑制活性。将本研究结果与文献中天然污染水平比较发现，尽管核桃目前受AF污染的频率低于开心果或花生，但文献数据显示核桃中有时可出现极高AF水平，如摩洛哥核桃中报道的浓度高达2,500 µg/kg（Juan等，2008），支持了核桃虽当前AF水平不令人担忧，但在欧洲未来气候情境下其积累高浓度AF的潜力可能成为健康隐患。

讨论与解读

本研究对接种黄曲霉后不同坚果基质中AFB1、AFB2和STC的定量分析揭示了这些曲霉毒素形成的显著菌株依赖性。受检菌株产生AFs和STC的能力差异显著，而核桃在所有受检坚果中始终支持明显更高的AF形成。这些发现将核桃鉴定为本研究实验条件下黄曲霉毒素合成的特别有利基质。这种增强敏感性的机制尚不清楚，可能与核桃特有的基质特性有关，如核桃独特的脂肪酸组成、营养可利用性或种皮完整性及其相关抗菌化合物。观察到的基质特异性差异表明，坚果类型可强烈影响黄曲霉的产毒潜力。

编译者解读

本研究的方法学亮点在于采用稳定同位素稀释分析结合UHPLC-MS/MS，实现了复杂坚果基质中三种真菌毒素的精确定量，校准范围覆盖0.01至100的宽动态区间。菌株-基质双维度的实验设计揭示核桃的特殊易感性，为食品安全风险评估提供了重要线索。然而，研究未深入解析核桃促进毒素合成的具体机制——脂肪酸谱、种皮完整性等因素仍停留在推测层面。从合成生物学应用角度，后续可借助代谢组学手段解析核桃基质中诱导黄曲霉毒素基因簇表达的关键信号分子，为设计产毒抑制策略提供靶点。

参考来源

Schneidemann-Bostelmann S, Nöth F, Asam S, Rychlik M. Quantification of aflatoxins and sterigmatocystin in walnuts, cashews, pistachios, peanuts, and hazelnuts by using UHPLC-MS/MS following Aspergillus flavus inoculation. Mycotoxin Res. PMID: 42550348. DOI: 10.1007/s12550-026-00666-w.

PMID: 42550348