来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space
蛋白酶是工业酶制剂中体量最大的一类，广泛应用于洗涤、食品、皮革和医药等行业。微生物来源的丝氨酸蛋白酶凭借广谱底物特异性和良好的稳定性，一直是工业开发的热点。然而，这类酶在异源宿主中过表达时，常常因细胞毒性或分泌效率低下而受阻。如何让宿主菌株“愿意”把更多的目标蛋白吐到胞外，是合成生物学和酶工程领域共同的难题。
2025年发表在Microbial Cell Fact上的一项研究，给出了一套组合拳式的解决方案。来自中国的研究团队以甲醇营养型酵母Komagataella phaffii（即毕赤酵母）为底盘，针对酸性稳定的碱性丝氨酸蛋白酶PrtA，将定向进化、机器学习辅助突变和信号肽工程三种策略叠加使用，最终在15-L发酵罐中实现了4807.5 U/mL的胞外酶活，折合蛋白浓度达1.5 g/L。这个数字比野生型提升了近5倍，而且酶的催化性质几乎没变。
研究背景
毕赤酵母是公认的蛋白质分泌利器。它的甲醇诱导型启动子（如AOX1）驱动能力强，翻译后修饰机制完善，且自身分泌的杂蛋白很少，这些特性让它在重组蛋白生产中占据重要地位。但毕赤酵母并非对所有异源蛋白都“来者不拒”。尤其是蛋白酶这类自带“破坏属性”的分子，过量表达时可能损伤宿主细胞，或者在分泌途中被自身降解，导致最终产量远低于理论预期。
PrtA是一种酸性稳定的碱性丝氨酸蛋白酶，在酸性环境下仍能保持活性，这种特性在工业应用中有独特价值。但正因为它是蛋白酶，在毕赤酵母中表达时面临的细胞毒性和自身降解问题格外突出。此前的研究多集中于单一策略——要么改造启动子，要么优化信号肽，要么突变蛋白本身。本研究的不同之处在于，它把三个层次的改造串联起来，试图系统性地打通从基因到胞外蛋白的整个通路。
研究方法
研究的技术路线分为三个递进阶段：先通过定向进化筛选高表达突变体，再用机器学习指导的饱和突变进一步挖掘潜力，最后用信号肽工程优化分泌效率。每一步都建立在上一轮最优结果的基础上。
菌株与载体系统
研究使用E. coli Trans1-T1作为克隆宿主，K. phaffii GS115作为表达宿主。表达载体选用了pPIC9和pPICZαA两种，均为毕赤酵母常用载体。酪蛋白钠盐（来自牛乳，Sigma-Aldrich C8654）作为蛋白酶活性测定的底物。限制性内切酶EcoRI、NotI和DraI购自Thermo Fisher Scientific。培养基包括BMGY、BMMY、MD和MM，均按照Invitrogen EasySelect™ Pichia Expression Kit手册配制。原文摘要未详述具体培养温度、转速和诱导时间等参数，但根据毕赤酵母表达系统的通用流程，通常使用30°C、250 rpm左右的摇瓶条件，甲醇诱导浓度一般为0.5%-1%。
基因合成与质粒构建
编码PrtA的基因（GenBank登录号XP_663162）按照毕赤酵母密码子偏好性进行了优化，由华大基因合成。成熟肽编码区用特异性引物PrtA-MF和Prt-MR扩增后，通过同源重组的方式克隆到pPIC9质粒中，与α-factor信号肽序列形成框内融合，构建出pPIC9-prtA-M。使用的克隆试剂盒为Transgen公司的Basic Seamless Cloning and Assembly Kit。构建产物经测序验证插入序列的正确性。原文摘要未详述具体PCR退火温度和延伸时间等参数。
转化与转化子筛选
重组质粒用Bgl II限制性内切酶线性化后，电转化进入K. phaffii GS115感受态细胞。His⁺转化子先在MD琼脂平板和MM琼脂平板上于30°C培养48小时进行初步筛选。用无菌牙签挑取单菌落进行后续验证。原文摘要未详述电转化的具体电压、电阻和电容参数，也未说明甲醇诱导表达的具体时间进程。
定向进化获得Q245K突变体
第一轮改造采用易错PCR或定点饱和突变等定向进化手段（原文摘要未详述具体突变文库构建方法），筛选出胞外表达量比野生型高1.35倍的Q245K突变体。这个突变位于第245位氨基酸，由谷氨酰胺（Q）变为赖氨酸（K）。该突变体的酶学性质与野生型保持一致，说明表达量的提升并非通过改变催化活性实现。
机器学习预测与I342D突变
研究团队开发了一个名为MPEPE（Mutation Predictor for Enhanced Protein Expression）的机器学习模型，用于预测哪些氨基酸残基对蛋白分泌至关重要。模型输出排名第一的位点被选为饱和突变靶点。在该位点（第342位异亮氨酸，I）进行19种氨基酸替换的饱和突变筛选后，获得I342D突变体，其产量比野生型提高1.48倍。第342位由异亮氨酸（I）变为天冬氨酸（D）。
双突变体的协同效应
将Q245K和I342D两个突变叠加，构建双突变体PrtA-Q245K/I342D。摇瓶水平验证显示，双突变体的分泌量达到野生型的1.84倍，高于两个单突变体的简单叠加（1.35 + 1.48 - 1 = 1.83倍，基本符合相乘模型），说明两个突变位点对分泌效率的贡献具有协同性。更重要的是，双突变体的酶学性质（如比活力、底物特异性、pH稳定性等）与野生型无显著差异。
信号肽工程
在获得最优突变体后，研究进入信号肽筛选阶段。共评估了9种信号肽，包括血清白蛋白信号肽、α-factor信号肽（不含前肽区）、PrtA自身天然信号肽，以及其他来源的信号肽。每种信号肽与双突变体编码序列融合，构建独立的表达菌株，在相同条件下比较胞外产量。原文摘要未详述9种信号肽的完整清单和各自来源，也未说明信号肽与成熟肽的具体连接方式。
15-L发酵罐放大
最终优化菌株（携带双突变体基因和最优信号肽组合）在15-L补料分批发酵罐中进行放大验证。发酵过程中采用甲醇诱导，通过在线监测和反馈控制维持适宜的诱导浓度。发酵结束后测定发酵液上清的蛋白酶活性。原文摘要未详述发酵时间、pH控制策略、溶氧设定和甲醇补料速率等关键参数。
研究结果
单点突变带来的表达增益
定向进化筛出的Q245K突变体，胞外表达量是野生型的1.35倍。这个增益虽然不算惊人，但它的价值在于证明了PrtA的分泌瓶颈可以通过改变蛋白自身序列来突破。机器学习模型预测并验证的I342D突变体，产量提升至野生型的1.48倍。两个突变叠加后，双突变体PrtA-Q245K/I342D的分泌量达到野生型的1.84倍，显示出两个位点之间的正向协同效应。这种协同并非简单相加——如果两个突变独立起作用，预期增益约为1.35×1.48≈2.0倍，实际1.84倍略低于完全独立模型，但仍显著高于任一单突变体。
信号肽筛选的意外发现
9种信号肽的筛选结果颇具戏剧性。血清白蛋白信号肽、α-factor（不含前肽区）和PrtA自身天然信号肽，三者的表现几乎持平——各自都能让双突变体的分泌量再翻一倍，最终使组合突变体的表达量达到野生型的4.98倍。这个结果说明，对于PrtA而言，信号肽的选择并非“非α-factor不可”，多种信号肽都能胜任。
真正值得注意的是α-factor前肽区（pro-region）的作用。当α-factor信号肽包含完整的pro-region时，产量急剧下降。这与毕赤酵母表达系统中的常见认知相反——许多文献报道pro-region对某些蛋白的正确折叠和分泌是必需的。但在PrtA这个案例中，pro-region的存在反而成了分泌的累赘。研究者推测，这可能与PrtA自身的蛋白酶活性有关——pro-region可能被PrtA切割，或者pro-region与PrtA的相互作用干扰了翻译后加工过程。原文摘要未详述pro-region导致产量下降的具体机制。
15-L发酵罐的最终验证
在最优菌株（双突变体+最优信号肽）的15-L补料分批发酵中，最终发酵液上清的蛋白酶活性达到4807.5 U/mL，折合蛋白浓度约1.5 g/L。这是摇瓶水平的数倍提升，表明该策略在工业规模上依然有效。原文摘要未提供发酵周期、甲醇消耗量、产率系数等发酵工程参数，也未说明最终菌株使用的是哪一种最优信号肽（血清白蛋白、α-factor无前肽区或PrtA天然信号肽中的哪一种）。
酶学性质的保持
整个改造过程中，从单突变体到双突变体再到信号肽优化菌株，PrtA的酶学性质始终没有发生明显改变。这意味着表达量的提升完全来自分泌效率的改善，而非催化活性的变化。对于工业应用而言，这一点至关重要——突变不改变酶的性能，就不需要重新优化应用条件。
讨论与展望
这项研究的策略价值在于“组合”二字。定向进化找到了第一个增益位点，机器学习预测找到了第二个，信号肽工程则解决了分泌通路的最后瓶颈。三步走的逻辑清晰，每一步的增益都可量化叠加，最终实现了近5倍的产量提升。这种系统性的改造思路，比单一策略的反复尝试要高效得多。
不过，研究仍有未解之处。Q245K和I342D两个突变究竟如何影响蛋白分泌？是改变了蛋白与分子伴侣的相互作用，还是影响了折叠中间体的稳定性？MPEPE模型内部的特征重要性分析是否揭示了与分泌相关的蛋白结构特征？α-factor前肽区为何会抑制PrtA分泌？这些问题原文摘要均未给出答案，有待后续研究深入解析。
从工业化角度看，4807.5 U/mL的胞外酶活已经具备一定的经济竞争力。若能进一步优化发酵工艺（如甲醇流加策略、诱导温度、pH控制），产量还有提升空间。MPEPE模型的成功应用也为其他“难表达”蛋白提供了可复用的方法论——先用机器学习缩小突变空间，再用饱和突变精确定位最优替换，远比盲目随机突变高效。
这项研究给蛋白酶异源表达领域提供了一套可借鉴的组合策略。对于其他具有细胞毒性或分泌障碍的重组蛋白，这套“定向进化+机器学习+信号肽工程”的流程或许同样适用。
参考来源
Zhao B, Zhou Q, Wei P, Zhang H, Qin X. A combined strategy for high-efficiency expression of alkaline protease PrtA in Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris). Microb Cell Fact. 2025. PMID: 41808135.
PMID: 41808135