核桃等坚果中黄曲霉毒素和杂色曲霉素的UHPLC-MS/MS定量分析

来源：Mycotoxin Res | 编译：DNA Lab Space

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导读

坚果营养丰富，却易被产毒真菌侵染。本研究以黄曲霉（Aspergillus flavus）接种五种市售坚果，利用UHPLC-MS/MS结合稳定同位素稀释分析，系统比较了黄曲霉毒素B1、B2和杂色曲霉素在不同坚果基质中的生成差异。结果显示核桃对毒素积累表现出显著敏感性，菌株间毒素产生能力差异巨大，为坚果真菌毒素风险评估提供了关键数据。

研究背景

坚果在全球范围内被广泛消费，因其富含蛋白质、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，是营养密度最高的食物类别之一。尽管从植物学角度，腰果仁、开心果和花生并不属于真正的坚果，但日常语言中"坚果"一词被广泛使用，本研究统一采用这一集合术语指代全部研究对象。

坚果类产品在德国市场的重要性持续上升：2018年德国树坚果种植面积仅600公顷，2024年已增至1,600公顷；2024/25年度坚果和果干消费量达48.2万吨；2024年德国坚果市场销售额约30.4亿欧元，预计2030年将接近39亿欧元。

树坚果易被多种真菌定殖，导致变质并产生有毒次级代谢产物。其中，产毒黄曲霉因能产生具有肝毒性的黄曲霉毒素而备受关注。黄曲霉毒素B1被国际癌症研究机构列为I类致癌物。杂色曲霉素作为黄曲霉毒素的生物合成前体，同样具有毒性和致癌性。本研究旨在通过受控接种实验，系统比较不同坚果基质对黄曲霉毒素和杂色曲霉素生成的影响。

研究方法

化学试剂与材料

LC-MS级乙腈和甲醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）；LC-MS级超纯水由Th. Geyer（德国雷宁根）提供。氯化钠购自Avantor（前VWR Darmstadt，德国），无水硫酸镁、甲酸、氨水溶液和甲酸铵溶液购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆），纯度均为分析级或更高。分散固相萃取净化管使用Supel™ QuE PSA/C18管，含400 mg Discovery™ DSC-18、1200 mg无水MgSO₄和400 mg Supelclean™ PSA，购自Sigma-Aldrich。Oxoid™林格氏液片剂购自Thermo Fisher Scientific（德国达姆施塔特），Tween® 80购自Sigma-Aldrich Canada Co（加拿大安大略），麦芽提取琼脂购自Millipore（加拿大安大略），乙醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）。

样品

去壳但未经其他处理的核桃、腰果、榛子、花生和开心果样品购自德国市场，在室温避光条件下储存至进一步处理。

分析标准品

含AFG1、AFG2、AFB1和AFB2各1 µg/mL的混合黄曲霉毒素乙腈溶液及未标记杂色曲霉素购自Romer Labs（前Biopure，奥地利图尔恩）。稳定同位素标记标准品[¹³C₁₇]AFG1、[¹³C₁₇]AFG2、[¹³C₁₇]AFB1、[¹³C₁₇]AFB2和[¹³C₁₈]STC由Fianovis（前Libios，法国Vindry-sur-Turdine）提供。

储备液配制

将购得的标记和未标记毒素储备液用乙腈进一步稀释，得到0.1、0.01和0.001 µg/mL的工作浓度。所有溶液于-28 °C储存。

黄曲霉菌株

为考察菌株特异性差异，基于机构可用性选取了五株产毒潜力不同或未表征的黄曲霉菌株：DSM 1959、NRRL 3357、AF 70、CBS 119.62和NRRL 1957。所有黄曲霉菌株在慕尼黑工业大学微生物学教研室麦芽提取琼脂上培养。

黄曲霉接种

孢子悬浮液制备：黄曲霉菌株在麦芽提取琼脂上培养以获得孢子，用无菌林格-Tween溶液（25%（w/v）林格氏液水溶液，0.1% Tween（v/v））收集孢子。孢子悬浮液浓度通过将系列稀释液涂布于麦芽提取琼脂并计数菌落来确定。随后用林格-Tween溶液将孢子悬浮液稀释至约1×10⁵孢子/mL，并通过重新涂布和菌落计数验证。孢子悬浮液的制备方法改编自弗劳恩霍夫过程工程与包装研究所的方案。

表面消毒：按照Amini等（2016）的方法，使用95%乙醇进行表面消毒。将坚果仁浸入乙醇/水溶液（95:5，v/v）中，在层流罩（BDK，德国松嫩比尔-根金根）内室温过夜干燥。之后将坚果放入配有含0.2 μm孔径膜的DURAN®盖的无菌实验室烧瓶中。表面消毒效果在预实验中评估：取10 g核桃，用5 mL林格-Tween溶液剥离表面微生物，随后涂布于麦芽提取琼脂。预实验确认了95%乙醇对核桃仁表面消毒的有效性。选择该方法是为了尽量减少对样品材料的改变——高温高压灭菌等处理可能影响真菌生长和黄曲霉毒素生成潜力。

接种：接种设两个生物学重复。核桃样品接种所有五株黄曲霉菌株，而腰果、榛子、花生和开心果样品仅接种AF 70和CBS 119.62菌株。对照样品用无菌林格-Tween溶液代替孢子悬浮液处理。接种条件参照Assunção等（2015）的方案：100 g表面消毒的坚果仁与相当于仁质量2%（w/w）的孢子悬浮液混合，在气候箱（Climacell EVO，MMM Group，德国慕尼黑）中于30 °C、95%相对湿度下培养20天，设两个生物学重复。

孢子灭活：基于黄曲霉孢子的热敏感性（Zhang等，2018），接种实验结束后样品立即在55 °C干燥90 min，以实现完全孢子灭活。

研磨：每个样品随后用实验室研磨机（Grindomix GM 200，Retsch GmbH，德国哈恩）研磨，于-28 °C储存至进一步样品制备。

水分含量

使用水分分析仪（Kern & SOHN GmbH，德国巴林根-弗罗默恩）通过红外干燥测定样品水分含量。取2.5 g均质化样品，于120 °C干燥至恒重，根据记录的质量损失计算水分含量。

真菌毒素提取

所有样品（未处理坚果、表面消毒坚果、对照和接种坚果）均按照Schneidemann-Bostelmann等（2026）的方案进行样品制备，每个样品设三个平行。所有细节汇总于补充信息（补充表1）。

方法验证

所用方法已按照Vogelgesang和Hädrich（1998）的方案完成验证（Schneidemann-Bostelmann等，2026），验证结果汇总于补充信息（补充表2）。

校准与定量

所有分析物通过稳定同位素稀释分析进行定量。校准曲线通过将固定量的稳定同位素标记内标与不同浓度的相应未标记分析物组合制备，得到n(A)/n(IS)摩尔比在0.01至100之间（1:100、1:50、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1）。将色谱峰面积比[A(A)/A(IS)]对相应摩尔比[n(A)/n(IS)]作图，构建校准函数。采用线性回归获得响应曲线，线性通过Mandel拟合检验验证。

UHPLC-MS/MS分析

UHPLC-MS/MS测定以Dick等（2024）和Schneidemann-Bostelmann等（2026）先前描述的方法为基础，但移除了与本研究中不相关分析物，仅保留黄曲霉毒素和杂色曲霉素。色谱分离使用Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统（Shimadzu，日本京都）。采用Waters BEH C18 UHPLC色谱柱（Acquity BEH C18，100 mm，1.7 μm × 2.1 mm；Waters GmbH，德国埃施博恩），柱温40 °C。流动相流速0.3 mL/min。二元梯度由溶剂A（5 mM甲酸铵水溶液，用25% NH₄OH溶液调至pH 9）和溶剂B（甲醇）组成。梯度程序：5% B保持2 min，1 min内升至18% B，随后2 min内逐渐升至25% B，8 min内升至90% B，0.5 min内进一步升至99% B并保持2 min，3.5 min内返回5% B，随后5 min再平衡。样品进样体积——原文未详述。

研究结果

不同坚果类型中检出的真菌毒素水平综合数据（包括AFB1、AFB2和STC）见图5和图6。精确浓度列于补充信息（补充表4–7）。对照及接种AF70和CBS 119.62菌株的坚果图像见补充信息（补充图1–22）。

不同菌株接种核桃后黄曲霉毒素和杂色曲霉素的生成

对接种不同黄曲霉菌株的核桃中黄曲霉毒素和杂色曲霉素的定量分析显示，AFB1、AFB2和STC的产生具有强烈的菌株依赖性，而所有样品中均未检出AFG1和AFG2。这一观察与黄曲霉已知的生物合成能力高度一致——黄曲霉产生B型黄曲霉毒素和杂色曲霉素，但不产生G型黄曲霉毒素（Ráduly等，2020）。因此可以认为接种成功，且未发生与其他曲霉属物种的交叉污染。未处理的核桃未检出黄曲霉毒素或杂色曲霉素，表面消毒的样品同样未检出。两个对照样品中有一个检出低水平AFB1（0.18 ± 0.09 µg/kg），且该样品出现可见真菌污染。虽然菌丝体的表型外观类似曲霉属，但未进行分类学确认。鉴于核桃产自德国——该地区自然污染产毒黄曲霉或寄生曲霉在生态学上极不可能——且消毒方案已在预实验中验证，这一单次事件最可能代表二次实验室污染，而非原料的基线定殖。

逐一考察各黄曲霉菌株可以发现，几乎所有菌株都能产生AFB1。此处报告的AFB1浓度增加特指初始未接种基质的基线水平与培养后检出水平之间的差异。在α = 0.05显著性水平下，接种AF70菌株的样品（1494 ± 180 µg/kg和超过11,000 µg/kg）、接种CBS119.62菌株的样品（0.30 ± 0.02 µg/kg和23.4 ± 4.95 µg/kg）、接种NRRL 1957菌株的样品（0.18 ± 0.09 µg/kg和0.95 ± 0.02 µg/kg）以及接种NRRL 3357菌株的样品（569 ± 82.6 µg/kg和151 ± 1.31 µg/kg）中AFB1浓度均显著增加。只有DSM 1959菌株无法在核桃上产生AFB1。AFB2和STC仅由AF70菌株（AFB2：147 ± 13.6 µg/kg和1,411 ± 298 µg/kg；STC：60.2 ± 2.17 µg/kg和262 ± 36.1 µg/kg）、NRRL 3357菌株（AFB2：76.8 ± 3.92 µg/kg和9.51 ± 0.86 µg/kg；STC：4.00 ± 0.06 µg/kg和1.29 ± 0.20 µg/kg）以及CBS 119.62菌株的一个生物学重复（AFB2：3.58 ± 0.38 µg/kg；STC：0.26 ± 0.04 µg/kg）在显著水平上产生。然而，由于NRRL 3357菌株的菌丝生长明显强于AF70和CBS 119.62，我们决定使用AF70和CBS 119.62接种其他坚果品种。这一选择主要出于安全考虑——尽量减少后续样品均质化过程中的粉尘形成和潜在孢子气溶胶化，降低生物安全风险。生物学重复之间观察到的差异可能由潜在的热点效应解释：如果重复样品中某一颗坚果的毒素浓度高于其他坚果，接种后均质化可能导致样品总黄曲霉毒素水平升高。

接种AF70和CBS 119.62菌株后五种坚果中黄曲霉毒素和杂色曲霉素的生成

与核桃中的观察一致，腰果、开心果、榛子和花生中仅检出B型黄曲霉毒素和杂色曲霉素，未检出G型黄曲霉毒素，表明黄曲霉接种成功且无交叉污染。未处理的榛子和腰果不含AFB1、AFB2和STC，而开心果原料含有AFB1（0.76 ± 0.11 µg/kg）、AFB2（0.35 ± 0.06 µg/kg）和STC（0.22 ± 0.01 µg/kg）。花生原料被STC污染（0.25 ± 0.01 µg/kg）。

考察用于接种不同坚果基质的两个菌株可以发现，AF70菌株能在除开心果外的所有坚果上产生AFB1，且与各自起始材料相比，AFB1浓度在α = 0.05显著性水平下显著增加（腰果：0.11 ± 0.01 µg/kg和0.16 ± 0.02 µg/kg；榛子：0.11 ± 0.01 µg/kg和3.56 ± 0.90 µg/kg；花生：0.16 ± 0.05 µg/kg和17.9 ± 8.27 µg/kg）。接种AF70菌株导致腰果中AFB2浓度升高（两个样品均在LOD和LOQ之间）、花生中升高（5.43 ± 0.94 µg/kg和6.54 ± 1.19 µg/kg），以及接种榛子的一个生物学重复中升高（0.18 ± 0.02 µg/kg），而STC仅在花生的一个生物学重复（5.28 ± 0.18 µg/kg）和榛子的一个生物学重复（0.08 ± 0.02 µg/kg）中观察到。在开心果上，该黄曲霉菌株未产生任何黄曲霉毒素或杂色曲霉素。与核桃上的毒素生成相比，该菌株在核桃上产生的AFB1、AFB2和STC浓度明显高于其他受检坚果。

CBS119.62菌株仅在花生的一个生物学重复中产生AFB1（0.06 ± 0.01 µg/kg），在花生中产生AFB2（7.59 ± 1.13 µg/kg和0.26 ± 0.04 µg/kg），并在榛子的一个生物学重复中产生AFB2（0.13 ± 0.03 µg/kg）。与在核桃上的行为相反，该菌株在其余受检坚果上均未产生STC。黄曲霉菌株CBS 119.62无法在开心果上产生黄曲霉毒素或杂色曲霉素。与核桃中的情况一致，其他坚果也应考虑热点效应的可能性——单颗受污染果仁即可导致个别样品中黄曲霉毒素水平升高。

不同坚果基质上黄曲霉毒素和杂色曲霉素生成的比较及文献数据

比较不同坚果基质上的黄曲霉毒素生成可以发现，受试黄曲霉菌株在核桃上产生的B型黄曲霉毒素和杂色曲霉素浓度显著高于其他坚果。这与Molyneux等（2007）的发现形成对比——该研究报道核桃因没食子酸和其他抗氧化化合物而具有抑制黄曲霉毒素的特性。然而，他们也指出这些化合物必须存在于种皮中而非胚乳中，因为不含种皮的果仁材料未表现出抑制活性。

水分含量

图7显示了不同坚果类型在接种前后的水分含量。水分含量是影响真菌生长和毒素产生的重要基质参数之一。

讨论与解读

对不同坚果基质接种黄曲霉后AFB1、AFB2和STC的定量分析揭示了这些曲霉毒素生成的显著菌株依赖性。受试菌株在产生黄曲霉毒素和杂色曲霉素的能力上差异显著，而核桃 consistently 支持比其他四种坚果更高的黄曲霉毒素生成。这些发现将核桃确定为在本研究实验条件下黄曲霉毒素合成的特别有利基质。这种增强敏感性的机制尚不清楚，可能与核桃特有的基质性质有关，如核桃独特的脂肪酸组成、营养可利用性或种皮完整性及其相关抗菌化合物。观察到的基质特异性差异表明，坚果类型可以强烈影响黄曲霉的产毒潜力。

尽管核桃目前受黄曲霉毒素污染的频率低于开心果或花生，但文献数据显示，某些情况下核桃中可出现极高水平的黄曲霉毒素——如摩洛哥核桃中报道的浓度高达2,500 µg/kg（Juan等，2008）。这支持了本研究结果，表明尽管核桃中黄曲霉毒素目前尚不令人担忧，但在未来气候变化的背景下，核桃积累高浓度黄曲霉毒素的潜力可能成为欧洲未来健康关注点。

编译者解读

本研究的方法学亮点在于采用稳定同位素稀释分析结合UHPLC-MS/MS，实现了复杂坚果基质中痕量真菌毒素的精确定量——这是合成生物学中"检测-定量"闭环的关键技术支撑。值得注意的是，作者在安全考量下舍弃了产毒最强的NRRL 3357菌株用于多基质比较，体现了实验设计与生物安全之间的权衡。核桃作为"高敏感基质"的发现，提示合成生物学在抗真菌工程或毒素降解酶开发方面可以核桃为优先靶标。不过，体外接种条件与自然污染场景的差异仍需谨慎对待，机制层面的验证尚待深入。

参考来源

Schneidemann-Bostelmann S, Nöth F, Asam S, Rychlik M. Quantification of aflatoxins and sterigmatocystin in walnuts, cashews, pistachios, peanuts, and hazelnuts by using UHPLC-MS/MS following Aspergillus flavus inoculation. Mycotoxin Res. PMID: 42550348. DOI: 10.1007/s12550-026-00666-w.

PMID: 42550348