来源：Adv Sci (Weinh) | 编译：DNA Lab Space
构建最小基因组，是合成生物学长久以来的目标。它不只是把基因组“做小”，更是为了回答一个根本问题：一个生命维持生存，最少需要多少基因？然而，这一目标的实现长期被两座大山阻挡——必需基因清单不完整，以及反复试错式的基因组删减流程。针对这两大瓶颈，一项名为CREAT的新策略横空出世。它把CRISPR靶向切割与同源臂“行走”结合起来，一次性完成必需基因的鉴定与基因组删减，并在冰岛硫化叶菌中实现了八轮连续操作、基因组缩减20.8%的成绩。
研究背景
最小基因组研究的意义早已超出基础科学范畴。一个基因组成分明确、代谢负担低的微生物底盘，可以更高效地生产化学品、药物或生物燃料。然而，构建这样的底盘面临一个先决条件：必须知道基因组中哪些基因是生存所必需的，哪些是可以删去的“冗余”。
传统上，必需基因的鉴定依赖转座子插入突变或单基因敲除，工作量大且难以覆盖所有基因。而基因组删减本身也充满不确定性——每删一段，都要验证细胞是否存活，删错了就得重来。这种“试错”模式在多轮删减时尤为耗时。
CREAT策略的设计初衷，正是为了同时解决这两个问题。它利用CRISPR系统在基因组特定位点制造双链断裂，再通过多同源臂模板引导修复，在一次操作中既测试目标区域是否为必需区段，又完成删减。若细胞存活，说明该区域非必需，可继续删减；若细胞死亡，则说明该区域含有必需基因，需改用合成基因盒替换的方式绕行。
研究方法
本研究的实验体系涉及三类微生物：古菌冰岛硫化叶菌（Saccharolobus islandicus）E233S菌株，以及细菌中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168和大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655。
菌株与培养条件。 Sa. islandicus E233S衍生自Sa. islandicus REY15A，敲除了pyrEF和lacS基因。该菌株在76°C下于SCV培养基或USCV培养基中培养（如需补充尿嘧啶，浓度为20 µg/mL），摇床转速150 rpm。E. coli MG1655和B. subtilis 168则使用Luria-Bertani（LB）培养基（Solarbio，北京）或添加1.5%琼脂的LB平板培养，温度分别为37°C和30°C，按需添加抗生素。
比较基因组分析。 研究团队使用Mauve软件对Sa. islandicus REY15A与Sa. islandicus M.16.4进行全基因组共线性比对，以M.16.4基因组为参考。比对采用默认参数（种子序列长度=15，最小LCB权重=3），算法自动识别局部共线性区块（LCBs），仅保留长度≥10 kb且含有≥5个保守基因的区块进行后续分析。基因组重排事件依据比对结果中区块的位置偏移和方向变化推断。基因对应关系通过MUMmer工具建立，并经BLASTP验证。
串联多同源臂阵列的制备。 每个同源臂片段（HA1, HA2, …, HAn）使用Phanta Max Super Fidelity DNA聚合酶（Vazyme）通过PCR扩增。PCR产物纯化后，等摩尔量混合，加入高保真DNA聚合酶（不添加引物），进行12轮……（原文此处截断，未详述后续循环参数）。
CRISPR介导的大片段删除。 在Sa. islandicus中，携带人工mini-CRISPR位点的质粒转录产生crRNA，引导内源IA型CRISPR-Cas系统的Cascade蛋白复合物在靶位点实现切割。质粒上的修复模板介导DNA双链断裂的定向修复，最终得到目标区域删除的突变染色体。基因组编辑转化子在缺乏尿嘧啶的培养基（Uracil-）上筛选，存活突变体在补充尿嘧啶的培养基（Uracil+）上分离，以促进pGE质粒丢失。侧翼引物对gSn-FP-F和gSn-FP-R用于检测突变位点存在与否；内部引物（gSn-IP-F/gSn-IP-R）用于检测仅存在于野生型菌株中的内部标记。
Cas9介导的CREAT系统。 对于B. subtilis和E. coli，研究团队开发了基于Cas9的CREAT基因组修剪方案。在E. coli中，λ-Red重组酶显著提升了编辑效率。
研究结果
经典CRISPR大片段删除揭示额外必需基因。 此前对Sa. islandicus M16.4的全基因组Tn5插入突变分析鉴定出441个必需基因。这些必需基因大多聚集在Sulfolobales生物中保守的三个复制起点附近，只有少数分散在远离复制起点的区域。这种分布模式在古菌基因组中形成了“必需区段”与“非必需区段”的交替格局。
六大片段的删除尝试与必需基因的重新定义。 研究团队在Sa. islandicus REY15A基因组中识别出6个最大的预测可删除区段，命名为gS1–gS6。通过内源IA型CRISPR-Cas系统介导的大片段删除实验，他们发现——并非所有预测的非必需区段都能被成功删除。部分区段的删除导致细胞死亡，说明这些区域虽然缺乏已知必需基因，但实际含有未被注释的必需功能。这一结果直接印证了研究团队的判断：仅靠转座子突变数据预测必需基因并不可靠，必须通过实际删除实验来验证。
八轮连续修剪，基因组缩减20.8%。 在明确哪些区段可直接删除、哪些区段需绕行后，研究团队启动多轮CREAT基因组修剪。他们将鉴定出的必需基因组装成合成基因盒，用于一步替换那些无法直接删除的基因组区域。经过八轮连续的CREAT操作，Sa. islandicus的基因组大小减少了20.8%。这一数字意味着，该古菌超过五分之一的基因组被证明在实验室培养条件下是非必需的。
CREAT在细菌中的拓展。 研究团队进一步将CREAT策略推广至细菌系统。基于Cas9的CREAT基因组修剪在B. subtilis和E. coli中成功建立。在E. coli中，λ-Red重组酶的引入使编辑效率大幅提升。这证明CREAT并非古菌专属工具，而是一个跨物种适用的通用策略。
讨论与展望
CREAT策略的核心创新，在于把“鉴定必需基因”和“删减基因组”这两个原本分离的步骤合并为一步。传统流程中，研究者先通过转座子突变等手段建立必需基因清单，再据此设计删除方案。CREAT则直接用CRISPR切割测试目标区段的必需性——切完能活，就是非必需；切完死了，就改用合成基因盒替换。这种“以删代鉴”的思路，大幅减少了试错轮次。
八轮删减20.8%的成绩，在古菌中尚属首次。更值得注意的是，该策略在细菌中的成功拓展表明，其底层逻辑不依赖于特定物种的DNA修复机制。λ-Red重组酶对E. coli编辑效率的增强作用，也提示了进一步优化CREAT在真核生物中应用的潜在方向。
当然，CREAT仍有改进空间。例如，目前鉴定必需基因的判据是“删除后细胞是否存活”，这只能反映实验室培养条件下的必需性，无法覆盖自然环境中的生存需求。此外，多同源臂模板的制备与验证流程仍有自动化潜力。未来若能与高通量合成生物学平台结合，CREAT有望成为快速构建各类微生物最小基因组的标准化工具。
参考来源
Yuan G, Gao Z, Qi Y, Zhang Y, Tian X. CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction. Adv Sci (Weinh). PMID: 42371672.
PMID: 42371672