维生素A生产：代谢工程改造β-胡萝卜素与视黄醇通路

📅 2026-08-10 📰 Microb Cell Fact 2026 May 12 📂 研究进展 👁 25

来源：Microb Cell Fact | 编译：DNA Lab Space

导读

维生素A是人体必需的微量营养素，传统化学合成法面临严峻的环境挑战。本研究首次将油脂酵母 Lipomyces starkeyi 工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素合成与裂解关键酶，结合甲羟戊酸（MVA）通路强化，在3 L补料分批发酵中实现超过600 mg/L的维生素A产量。双相培养系统使90%以上的产物分泌至细胞外相，Fe²⁺补充进一步提升了产量，为可持续维生素A生产开辟了新路径。

研究背景

维生素A对视觉、免疫功能和细胞分化至关重要。传统生产以化学合成为主，环境负担显著。微生物发酵虽为可持续替代方案，但产量与成本效益尚难与化学合成匹敌。产油酵母——如 Lipomyces starkeyi——能合成高水平的乙酰辅酶A和脂质，是生产维生素A等高价值亲脂性化合物的理想平台。本研究首次将 L. starkeyi 工程化为维生素A生产者，通过引入β-胡萝卜素与视黄醇生物合成通路的关键酶，系统优化MVA通路与发酵条件，实现了维生素A的高效生产。

研究方法

菌株与培养基

本研究所用酵母菌株列于表1。L. starkeyi ∆lslig4（同源重组效率增强菌株）用于构建维生素A生产菌株，该菌株源自 L. starkeyi CBS1807。S. cerevisiae 改造使用亲本菌株YPH499（Stratagene, CA, USA）。L. starkeyi 和 S. cerevisiae 菌株于30°C在YPD培养基（1% Bacto™ Yeast Extract（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、2% Bacto™ Peptone（Thermo Fisher Scientific）、2%葡萄糖）中培养。固体培养基添加2% Bacto™ Agar（Thermo Fisher Scientific），视需要补充100 μg/mL Geneticin™（Thermo Fisher Scientific）、100 μg/mL潮霉素B（FUJIFILM Wako Pure Chemical, Japan）、30 μg/mL诺尔丝菌素（FUJIFILM Wako Pure Chemical）和/或50 μg/mL Zeocin™（Invitrogen Corporation, CA, USA）。S. cerevisiae 菌株于30°C在合成限定（SD）培养基中培养，该培养基含0.17%酵母氮碱（不含氨基酸和硫酸铵，Thermo Fisher Scientific）、0.5%硫酸铵（Nacalai Tesque, Japan）、2%葡萄糖和0.14%酵母合成 dropout 补充物（不含尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸和色氨酸，Sigma-Aldrich, MO, USA）。根据需要向培养基中添加尿嘧啶（100 μg/mL）、亮氨酸（30 μg/mL）、色氨酸（80 μg/mL）和组氨酸（100 μg/mL）（FUJIFILM Wako Pure Chemical）。固体培养基添加2% Bacto™ Agar。

表1 本研究所用酵母菌株

Lipomyces starkeyi

| 菌株名称 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |

|---|---|---|---|

Saccharomyces cerevisiae

| 菌株名称 | 亲本菌株 | 描述 | 来源 |

|---|---|---|---|

| YPH499 | — | MATa ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 | Stratagene |

| KHNU-S1 | YPH499 | YPH499, Δhmg1::PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1 | 本研究 |

E. coli HST08（Takara Bio, Japan）用于基因克隆和质粒扩增，于37°C在LB培养基（1%胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific）、0.5% Bacto™ Yeast Extract、0.5% NaCl）中培养，添加100 mg/L氨苄青霉素筛选。

通用分子生物学技术

聚合酶链式反应（PCR）使用KOD Fx Neo和KOD One DNA聚合酶（TOYOBO, Japan），按制造商说明书操作。基因组DNA使用Gen Toru-Kun酵母试剂盒（Takara Bio）提取，质粒DNA使用QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN, Germany）提取。限制性内切酶购自Takara Bio。

质粒与菌株构建

质粒和菌株构建所用引物列于表S1。异源基因——包括来自未培养海洋细菌66A03的 Blh（MbBlh）、来自 Mucor circinelloides 的 CarRP 和 CarB（McCarRP和McCarB）、来自 Xanthophyllomyces dendrorhous 的 CrtE（XdCrtE）——均针对 L. starkeyi 表达进行了密码子优化，由Eurofins Genomics（Japan）合成（表S2）。来自 Croton stellatopilosus 的 XdCrtE 和 CsPDP 基因（均针对 S. cerevisiae 进行密码子优化）由Eurofins Genomics合成（表S2）。

为构建 S. cerevisiae 菌株KHNU-S1，组装了基因组整合盒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1，步骤如下：首先，从 S. cerevisiae YPH499基因组DNA扩增HMG1的5′和3′非翻译区（UTR），引物对分别为ScHMG1_us_F/cHMG1_us_R和ScHMG1_ds_F/ScHMG1_ds_R。载体骨架用pBlue_F1/pBlue_R1引物从pBluescript II KS(+)扩增。这些DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix（Takara Bio）连接，生成pBlue-HMG1us-HMG1ds。随后，分别用PGK1p_F/PGK1p_R和PGK1t_F/PGK1t_R引物对从YPH499基因组DNA扩增PGK1启动子和终止子。KanR基因用G418r_F1/G418r_R1引物从质粒pGKNEO2扩增。载体骨架用pBlue_F2/pBlue_R2引物从pBluescript II KS(+)扩增。所得DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix连接，构建pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66。最后，用pBlue_HMG1_vec_F/pBlue_HMG1_vec_R引物从pBlue-HMG1us-HMG1ds扩增载体骨架，用G418r_F2/G418r_R2引物从pBlue-lox71-PGK1p-KanR-PGK1t-lox66扩增KanR表达盒，用ScHMG1_F/ScHMG1_R引物从pARS308-ERG12-tHMG1-URA扩增tHMG1表达盒。这些DNA片段用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得最终质粒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1。

为构建 S. cerevisiae 表达质粒pYES2(LEU2)-CsPDP、pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，先将亲本载体pYES2/CT中的标记基因 URA3 替换为 LEU2 或 HIS3，分别生成pYES2(LEU2)-empty或pYES2(HIS3)-empty。LEU2 和 HIS3 DNA片段分别用引物对LEU2_F/LEU2_R和HIS3_F/HIS3_R从 S. cerevisiae 基因组DNA扩增。所得PCR产物与pYES2/CT骨架片段（用pYES2CT_F/pYES2CT_R引物扩增）通过In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(LEU2)-empty和pYES2(HIS3)-empty。

为构建pYES2(LEU2)-CsPDP，用CsPDP_Sc opt_F/CsPDP_Sc opt_R引物扩增针对 S. cerevisiae 密码子优化的 CsPDP 基因（Eurofins Genomics合成），与用pYESCT_F2/pYESCT_R2引物扩增的pYES2(LEU2)-empty骨架通过In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装。为构建pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE，分别用LsGGS1_Sc opt_F/LsGGS1_Sc opt_R引物从 L. starkeyi 扩增LsGGS1 cDNA，用XdCrtE_Sc opt_F/XdCrtE_Sc opt_R引物扩增针对 S. cerevisiae 密码子优化的 XdCrtE 基因（Eurofins Genomics合成）。各扩增基因片段与pYES2(HIS3)-empty骨架（用pYESCT_F2/pYESCT_R2引物扩增）使用In-Fusion® Snap Assembly Master Mix组装，获得pYES2(HIS3)-LsGGS1和pYES2(HIS3)-XdCrtE。

S. cerevisiae 菌株KHNU-S1的构建方法为：将质粒pBlue-PTDH3-tHMG1-TTDH3-PPGK1-KanR-TPGK1经XhoI酶切并纯化后转化细胞。KHNU-S2通过将pYES2(LEU2)-CsPDP和pYES2(HIS3)-empty载体导入KHNU-S1获得。同样，KHNU-S3和KHNU-S4分别通过将pYES2(LEU2)-CsPDP与pYES2(HIS3)-LsGGS1或pYES2(HIS3)-XdCrtE共转化KHNU-S1获得。

为构建 L. starkeyi 菌株KHNU-1和KHNU-2的β-胡萝卜素生产质粒，开发了表达盒pKS/lig4/McCarRP-McCarB和pKS/tgl3/XdCrtE。对于pKS/lig4/McCarRP-McCarB，从 L. starkeyi 基因组DNA扩增以下DNA片段：LsLIG4的5′和3′ UTR（引物：lig4_us_F/lig4_us_R和lig4_ds_F/lig4_ds_R）、70486启动子和终止子（原文未详述具体引物序列）。

▲ Overview of metabolic pathways engineered for vitamin A biosynthesis in Lipomyces starkeyi . Schematic representation of

图1展示了 L. starkeyi 中维生素A生物合成的代谢工程通路总览——MVA通路（粉色）产生萜类前体DMAPP和IPP，缩合为GPP、FPP和GGPP；β-胡萝卜素通路（黄色）通过来自 Mucor circinelloides 的八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶（McCarRP）和八氢番茄红素脱饱和酶（McCarB）将GGPP转化为β-胡萝卜素；来自 Xanthophyllomyces dendrorhous 的异源GGPP合酶（XdCrtE）增强FPP到GGPP的代谢流；维生素A通路（橙色）通过来自海洋细菌66A03的β-胡萝卜素加双氧酶（MbBlh）将β-胡萝卜素转化为视黄醛，再由内源视黄醛还原酶（ENV9）或其他视黄醛还原酶还原为视黄醇。TAG生物合成（蓝色）和降解（紫色）提供储存和乙酰辅酶A循环以支持萜类代谢。异源基因以红色显示，L. starkeyi 内源基因以黑色显示。

研究结果

L. starkeyi 首次被工程化为维生素A生产菌株，通过引入β-胡萝卜素和视黄醇生物合成通路的关键酶实现。该方法包括整合编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶（McCarRP）、八氢番茄红素脱饱和酶（McCarB）和β-胡萝卜素15,15′-加双氧酶（MbBlh）的基因。MVA通路的进一步优化使3 L补料分批发酵中维生素A产量超过600 mg/L。Fe²⁺补充提高了产量，而使用十二烷和丁基羟基甲苯的双相培养系统增强了维生素A的回收率，90%以上的产物在细胞外相中被回收。

▲ Construction of β-carotene and vitamin A biosynthetic pathways in Lipomyces starkeyi and evaluation of MbBlh copy number

图2展示了 L. starkeyi 中β-胡萝卜素和维生素A生物合成通路的构建及MbBlh拷贝数对维生素A生产的影响。图2A比较了 L. starkeyi Δlslig4（对照）、KHNU-1和KHNU-2菌株的表型，显示随着异源β-胡萝卜素基因（McCarB、McCarRP、XdCrtE）的引入，色素沉着逐渐加深。图2B为KHNU-1和KHNU-2提取的β-胡萝卜素HPLC色谱图，与标准品对比。图2C评估了72 h时 S. cerevisiae 菌株KHNU-S2（内源BTS1）、KHNU-S3（过表达 L. starkeyi GGS1）和KHNU-S4（过表达XdCrtE）的GGPP合酶活性，GGOH通过GC/MS定量。图2D的HPLC色谱图确认了表达海洋细菌66A03 MbBlh的 L. starkeyi KHNU-3（Blh_18S_1）产生视黄醛和视黄醇。图2E比较了KHNU-3（Blh_18S_1）在72 h单相和双相培养下的维生素A产量，使用含1%（w/v）BHT的十二烷（20%，v/v）进行原位萃取。图2F比较了KHNU-3（Blh_18S_1–6）和KHNU-4（Blh_KU80）不同MbBlh拷贝数菌株在96 h的维生素A滴度。图2G通过定量PCR分析了KHNU-3（Blh_18S_1–6）菌株中MbBlh基因拷贝数。图2H通过qRT-PCR测定了48 h后KHNU-3（Blh_18S_1–6）菌株中MbBlh相对转录水平。数据显示为三次独立实验的均值±SEM；星号表示统计学显著差异（Student's t检验或Dunnett检验；* P < 0.05）。

▲ Enhancement of vitamin A production in Lipomyces starkeyi through reinforcement of the MVA pathway. A Effects of overexp

图3展示了通过强化MVA通路增强 L. starkeyi 维生素A生产的效果。图3A显示过表达HMG1和截短HMG1（tHMG1）对96 h培养后维生素A产量的影响，以KHNU-3菌株为亲本对照。图3B显示共过表达tHMG1、ERG10（乙酰辅酶A乙酰转移酶）和ERG13（HMG-CoA合酶）后96 h培养维生素A产量的进一步提升。图3A和图3B的数据来自在相同条件下独立进行的培养实验。数据显示为三次独立实验的均值±SEM。星号表示显著差异（Dunnett检验；* P < 0.05）。

▲ Effects of carbon source and Fe 2 ⁺ supplementation on vitamin A production in Lipomyces starkeyi KHNU-7. A Influence of

图4展示了碳源和Fe²⁺补充对 L. starkeyi KHNU-7维生素A生产的影响。图4A比较了不同碳源对工程菌株KHNU-7维生素A生产的影响——细胞在含2%（w/v）各指定碳源的YP培养基中，于20%（v/v）含1%（w/v）BHT的十二烷双相培养条件下培养96 h。图4B显示96 h后Fe²⁺补充对维生素A生产的影响——KHNU-7在含不同FeSO₄浓度（0–2.8 mM）的YPD培养基中培养。数据显示为三次独立实验的均值±SEM。星号表示统计学显著差异（Dunnett检验；* P < 0.05）。

▲ 工程菌株KHNU-7补料分批发酵生产维生素A：168小时内细胞生长（OD600）、胞内外维生素A、胞内β-胡萝卜素、葡萄糖及甘油三酯（TAG）的时间曲线，另

图5展示了工程菌株 L. starkeyi KHNU-7补料分批发酵生产维生素A的168 h时间进程曲线，包括细胞生长（OD600）、细胞外和细胞内维生素A、细胞内β-胡萝卜素、葡萄糖浓度和细胞内三酰甘油（TAG）。细胞外视黄醛和视黄醇以单独虚线显示，以区分其在发酵过程中的动态变化。数据代表三次独立实验的均值±SEM。

讨论与解读

本研究首次将 L. starkeyi 确立为可持续维生素A生产的潜力宿主。尽管产量已实现显著提升，但要达到经济竞争力水平，仍需进一步优化通路调控和发酵条件。这些发现为开发 L. starkeyi 作为维生素A及其他高价值萜类大规模生产平台奠定了基础。

编译者解读

本研究选择产油酵母 L. starkeyi 作为底盘，巧妙利用了其天然的高乙酰辅酶A和脂质供应能力——这恰好是萜类化合物合成的前体与储存库。双相培养配合BHT抗氧化策略，将90%以上的产物引导至细胞外，大幅简化了下游提取流程。MbBlh拷贝数系统筛选和MVA通路的模块化强化体现了合成生物学"设计-构建-测试-学习"的闭环逻辑。600 mg/L的产量在维生素A微生物合成领域具有标志性意义，但距离工业化仍有距离——视黄醛对视黄醇的转化效率、前体流向TAG储存与萜类合成之间的竞争平衡，是下一阶段值得深挖的调控靶点。

参考来源

Kinoshita A, Sato R, Higuchi H, Kobayashi S, Koketsu K. Efficient vitamin A production in Lipomyces starkeyi through metabolic engineering of the β-carotene and retinoid pathways. Microb Cell Fact. PMID: 42121163. DOI: 10.1186/s12934-026-03020-y.

PMID: 42121163

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