来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
光遗传学利用光在基因水平控制细胞功能，已在细胞生理、生物材料和代谢工程领域展现价值。酿酒酵母是工业相关模式生物，但受制于基因数量过多及不同颜色光之间的交叉激活问题，多波长光遗传一直未能在酵母中实现复用。本研究开发出仅需单基因、无需外源辅因子的紧凑型红光响应系统y-iLight，并通过模块化蛋白结构域工程降低蓝光交叉激活，与EL222蓝光系统整合后首次在酿酒酵母中建立双通道光遗传平台。研究团队进一步将该系统应用于黄酮类化合物木犀草素的合成调控及细胞絮凝沉降，并实现了双色活体材料的图案化打印。
研究背景
光遗传学是合成生物学的新兴领域，相比传统化学诱导方法具有避免有害化学品、与生物系统正交、可通过光照引入与撤除实现动态控制以及具备空间分辨能力等优势。目前已有覆盖红光、蓝光、绿光和紫外光等多种波长的光遗传系统，其独特优势在于可将不同颜色的光复用，实现对细胞中不同功能的独立正交控制。尽管多通道光遗传已在大肠杆菌和哺乳动物神经元中实现，但由于缺乏紧凑的正交光遗传系统以及不同颜色间的交叉激活问题，酿酒酵母中仅能应用单波长光遗传来开关特定通路。酿酒酵母遗传背景清晰，已被广泛用于化学品生产、药物合成、生物燃料、生物材料、环境诊断、替代食品及临床治疗等多种合成生物学应用。
研究方法
双通道光遗传在生物材料图案化中的应用
本研究涉及的双通道光遗传最终应用是利用光遗传的空间分辨能力。利用光图案在特定位置激活细胞中基因表达的能力，对生物材料研究、神经科学以及微生物群落相互作用研究具有重要价值。展示光遗传空间特性的常用方法是将图像投射到带有荧光或有色基因产物的细胞菌苔上，从而将图像"印刷"到细胞上。虽然大肠杆菌中已实现多色图像，但酿酒酵母中仅能通过单通道光遗传实现单色图像。
为实现多色图像，研究团队从OY-β.mA1LINX菌株构建了OY-γ.RB（红-蓝）菌株。lacZ酶被指定为蓝光通道的输出，CrtI被指定为红光通道的输出。在蓝光存在下，X-Gal被催化为蓝色染料（5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo）；在红光存在下，CrtI完成橙色β-胡萝卜素的生物合成（图8a和补充图15）。
OY-γ.RB在琼脂上生长为薄层细胞，使用Optobox将不同图像投射到表面（补充图16）。图案被裁剪到黑纸上，作为滤光片，先用红光照射选定区域24小时，再用蓝光照射24小时。研究发现，在这种情况下，不需要近红外光来消除交叉激活（补充图17）。利用该方法，研究团队成功印制了从字母到标志再到精细图像的多种多色图案，展示了系统的高空间分辨率及开发复杂活体材料的潜力。
红光通道的构建与测试
将细菌中展示的iLight版本直接适配到酿酒酵母存在困难，因为该蛋白缺乏在真核生物中发挥功能所需的激活域和核定位序列。此外，哺乳动物细胞中展示的版本也不宜使用，因为它利用了酿酒酵母Gal4 DNA结合域，无法与酿酒酵母生物学正交。为构建适合酿酒酵母的系统，研究团队将哺乳动物iLight变体的Gal4 DNA结合域替换为LexA蛋白——LexA常用于酿酒酵母正交合成转录因子。由于细菌变体利用的是突变型LexA域，研究团队推测野生型LexA在蛋白构象上同样功能正常。原SV40 NLS已融合在Gal4域的N端，因此将SV40 NLS重新附加到C端，产生了一个合成的酿酒酵母转录因子，命名为y-iLight。Y-iLight克隆在组成型酿酒酵母GAP1启动子（PGAP1）下游，并整合到酿酒酵母基因组位点YORWd17。同源启动子改编自Stelling等人，由8个串联lexO重复序列阵列组成，位于CYC1核心启动子（cPCYC1）上游。为评估不同核心启动子对系统的可能影响，又克隆了两个质粒，将cPCYC1替换为PGK1或ENO1核心启动子（cPPGK1或cPENO1）。这些启动子分别命名为PlexCYC1、PlexPGK1和PlexENO1，克隆到携带mCitrine荧光报告基因的低拷贝附加体质粒上游，并转化到表达y-iLight的酵母中（图2a）。
所有3个转化体均在光遗传光盒（Optobox，设备规格见补充注释15）上以0%、2.5%、10%、25%、50%和100%强度的红光培养。ACT1启动子（PACT1）在工业和研究应用中常被用作酿酒酵母的充分表征启动子。为衡量工程启动子是否能驱动足够水平的基因表达以满足实际应用，将其活性与PACT1进行比较。为此，构建了以组成型PACT1替换y-iLight启动子并连接mCitrine报告基因的质粒作为对照，同样在0%、25%、50%和100%红光强度下培养。与黑暗培养的细胞相比，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度的红光时均观察到表达增加（图2b）。这表明iLight已被成功改造为可在酿酒酵母中工作，无需任何额外辅因子。
不同核心启动子导致报告基因表达水平不同，研究还注意到PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。所有条件下培养物的OD600均未显示生长缺陷（补充图1a），表明红光未对细胞活力产生负面影响。由于这种非线性行为在三种核心启动子中均存在，很可能是y-iLight转录因子本身的特性所致。一种可能的解释是活性y-iLight的空间位阻，阻止其他转录因子和转录元件结合，因为转录激活因子在核心启动子附近的结合已被证明会因干扰RNA聚合酶结合而降低表达。另一种可能的机制是"促进扩散"，即当转录因子在DNA链上拥挤时，虽然初始结合速率增加，但转录因子的停留时间减少，导致启动子表达不佳。这两种机制都会表现为在活性转录因子高浓度存在时启动子表达降低。三种启动子可能对光具有不同的敏感性，因为核心启动子包含RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点以及DNA区域。
研究结果
在酿酒酵母中开发单组分红光通道
目前已为酿酒酵母、细菌和哺乳动物细胞开发了多种红光响应转录因子，但其缺点包括需要整合多个基因、添加外源辅因子，或需要额外基因在体内内源合成辅因子。考虑到双通道系统中包含过多基因可能对细胞造成代谢负担并增加克隆难度，研究团队寻求一种能够利用内源辅因子的功能性单组分红光敏感转录因子。虽然据其所知尚无此类系统在酿酒酵母中实现，但iLight系统此前已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中开发。iLight是一种单组分、远红光转录因子，通过对光敏IsPadC BphP蛋白进行工程改造获得。该蛋白由DNA结合域与来自IsPadC BphP的进化光敏核心模块（PCM）融合而成，PCM会形成同源二聚体，阻止DNA结合域的二聚化。暴露于红光（660 nm）时，PCM构象改变，允许DNA结合域二聚化，从而结合同源DNA序列。相反，近红外光（770 nm）会诱导从激活态到失活态的转变（图1c）。iLight在哺乳动物细胞中不依赖外源辅因子，因为它利用内源产生的胆绿素IXa。研究团队推断其在酿酒酵母中应具有类似功能，因为酿酒酵母已知表达天然血红素加氧酶Hmx1，可催化胆绿素的产生。
红光通道表征
当与黑暗培养的细胞相比时，所有三种y-iLight响应质粒在暴露于各种强度的红光时均观察到表达增加（图2b），表明iLight已成功改造为可在酿酒酵母中工作。不同核心启动子产生不同水平的报告基因表达。PlexCYC1和PlexPGK1在红光强度超过10%时y-iLight活性下降，而PlexENO1在红光强度大于50%时出现类似下降。OD600在所有条件下均未显示生长缺陷，表明红光未对细胞活力产生负面影响。
蓝光通道表征
EL222蓝光光遗传系统在酿酒酵母中表达（图2c）。BY474B细胞在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于0%-100%蓝光（光强度操作值见补充图19），以及100%蓝光30分钟与黑暗30分钟交替循环（三角形数据点表示）。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图2d）。
双通道正交性验证
BY474B菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于25%红光、25%蓝光或黑暗条件。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。使用双尾独立t检验对黑暗和红光条件的结果进行成对比较（图3a）。
BY474R在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于25%红光。初始暴露2小时后，细胞继续暴露于25%红光、50%近红外光或黑暗中3小时。荧光每小时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图3b）。
对y-iLight的变体进行了工程改造（图3c），包括光诱导核输出序列和光敏感降解子（图3d）。BY474R在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于25%红光、25%蓝光或25%蓝光加50%近红外光或黑暗。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为6个生物学重复的平均值，误差棒表示样本量n=6的标准差。结果用双尾独立t检验比较，NS = p > 0.1， = p < 0.1， = p < 0.05， = p < 0.01。深蓝色括号表示差异显著性；绿色括号表示交叉激活减少；红色括号表示蓝光抑制表达与红光激活表达的倍数差异。统计检验的P值见表2（图3e）。
y-iLightLINX、y-iLightmA1LINX和y-iLightmA6LEXY变体在不同光强度下培养，暴露于0-100%红光。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图3f）。
双通道同时激活
OY-α、OY-β.LINX、OY-β.mA1LINX和OY-β.mA6LEXY菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于50%近红外光加0-100%蓝光。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。mTurquoise表达结果见图4a，mCitrine表达结果见图4b。
上述菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于0-100%红光。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。mTurquoise表达结果见图4c，mCitrine表达结果见图4d。
为测试双通道同时激活，菌株在30 °C摇床培养箱中培养，暴露于60分钟循环的25%红光后接25%蓝光，或25%红光后接25%蓝光加50%近红外光，以及25%红光加25%蓝光同时照射和三种光同时照射。荧光在24小时时测量并标准化至OD600。值为6个生物学重复的平均值，误差棒表示样本量n=6的标准差（图4e、4f）。
木犀草素合成的光控生产
通过菱形途径将柚皮素酶促转化为木犀草素（图5a），构建了OY-γ.LutB/R(D)菌株的基因电路（图5b）。该菌株在30 °C摇床培养箱中以120分钟为周期培养，第一个数字表示暴露于蓝光加近红外光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。24小时后提取类黄酮并用HPLC表征。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图5c）。
OY-γ.LutB/R(D)在30 °C摇床培养箱中以120分钟为周期培养，第一个数字表示暴露于蓝光加近红外光的分钟数，第二个数字表示暴露于红光的分钟数。5小时后提取RNA，使用RT-qPCR定量F3'H（图5d）和FNSI（图5e）相对于UBC6管家基因的表达。将这些光照条件下的ΔCt与黑暗培养细胞的ΔCt进行比较，差异绘制在图表上。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差。
OY-γ.LutB/R(D)在30 °C摇床培养箱中培养，先暴露于25%蓝光加50%近红外光12小时，再暴露于25%红光12小时。每6小时提取类黄酮并用HPLC表征。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图5f）。
OY-γ.LutB/R(D)在30 °C摇床培养箱中培养，先暴露于25%红光12小时，再暴露于25%蓝光加50%近红外光12小时。每6小时提取类黄酮并用HPLC表征。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差（图5g）。
数学模型模拟
模拟了暴露于一个循环中不同比例的蓝光加近红外光后接红光照射时的类黄酮浓度（n=1）（图6a）。模型示意图阐明了从柚皮素产生木犀草素的两条途径的调控机制和反应动力学（图6b）。预测了在120分钟周期、24小时内不同蓝光加近红外光后接红光占空比下的类黄酮水平（n=1）（图6c）。预测了[12]小时光照周期下的时间响应曲线（n=1）（图6d）。将模型预测与实验数据进行比较，计算了决定系数R²值（图6e）。柱状图上的点表示用于比较的实验数据。
生长-生产-提取三相生物制造
OY-γ.LutFlo菌株用于生长-生产-提取三相生物制造流程（图7a），其基因电路如图7b所示。OY-γ.LutFlo在各种光照条件下的絮凝照片显示：培养物分别在黑暗中48小时、50%近红外光48小时、或25%蓝光加50%近红外光24小时及25%红光24小时条件下于30 °C摇床培养箱中培养（图7c）。
在不同培养阶段测量上清液的光密度。OY-γ.LutFlo和OY-γ.LutB(D)在30 °C摇床培养箱中培养，条件为：OY-γ.LutFlo暴露于30小时黑暗或24小时25%蓝光加50%近红外光后接6小时25%红光，OY-γ.LutB(D)暴露于24小时25%蓝光加50%近红外光后接6小时25%蓝光加50%近红外光。OY-γ.LutFlo另外在48小时黑暗、48小时50%近红外光或24小时25%蓝光加50%近红外光后接24小时25%红光条件下培养。在每个时间点测量上清液的OD600。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差，结果用双尾独立t检验比较，NS = p > 0.1， = p < 0.1， = p < 0.05， = p < 0.01（图7d）。
在不同培养阶段表征木犀草素产量。OY-γ.LutB(D)在30 °C摇床培养箱中于25%蓝光加50%近红外光下培养30小时，在24和30小时时间点测量类黄酮浓度。OY-γ.LutFlo在30 °C摇床培养箱中于25%蓝光加50%近红外光下培养24小时，后在25%红光下培养6小时。在24小时时从细胞培养物中提取类黄酮，在30小时时从上清液（顶层组分）或含有絮凝物的剩余培养物（底层组分）中提取类黄酮。值为3个生物学重复的平均值，误差棒表示以均值为中心、样本量n=3的标准差，结果用双尾独立t检验比较。标记比较的p值如下：(i)-0.00421，(ii)-0.777，(iii)-0.00562，(iv)-0.00378，(v)-0.000331（图7e）。
讨论与解读
单组分红光光遗传系统
研究团队为酿酒酵母改造了一个响应红光刺激的光遗传系统，仅需单个转录因子，不依赖任何外源添加的辅因子。这填补了酿酒酵母缺乏紧凑型单组分红光光遗传系统的空白，使光遗传在酿酒酵母中的复用应用成为可能。相比之下，最近开发的酿酒酵母红光响应转录因子PhiReX需要表达四种不同基因，包括用于合成酿酒酵母非内源辅因子的基因。PhiReX 1.1可实现高达41倍诱导，水平与天然启动子PADH1相当；PhiReX 1.0可实现约PADH1两倍的强度，但诱导倍数仅为11倍。y-iLight的诱导倍数为26倍，活性与另一个天然启动子PACT1相当。因此，y-iLight系统的动态范围介于PhiRex 1.0和1.1之间，同时与常用天然启动子水平相当。
蓝光交叉激活问题
阻碍双通道光遗传活性的一个意外交互作用是蓝光与红光通道之间的交叉激活。y-iLight的光敏辅因子胆绿素在其基态吸收可见光谱红光范围的波长，但研究发现蓝光也能影响该系统的活性。
编译者解读
本研究的关键突破在于用"最小化"策略解决了酵母多色光控的长期难题——单个转录因子加内源辅因子即可实现红光响应，避免了多基因整合带来的代谢负担。从合成生物学应用角度看，将双通道光控与絮凝沉降耦合实现"生长-生产-提取"三相流程，以及用光图案打印双色活体材料，均展示了从实验室工具向实际生物制造场景延伸的清晰路径。模型与实验的R²对比也为后续定量优化提供了框架。局限在于y-iLight的诱导倍数（26倍）仍有提升空间，且蓝光交叉激活虽经蛋白工程降低但未完全消除——这提示未来可进一步挖掘PCM突变体或利用合成启动子正交化策略来完善系统性能。
参考来源
Tan LYH, Lin Z, Yeoh JW, Zhang J, Poh CL. Dual-channel optogenetics in yeast for multiplexed light-based control of cellular processes and pathways. Nat Commun. PMID: 42173879.
PMID: 42173879