来源：Plant Physiol | 编译：DNA Lab Space
导读
甜菜红素是酪氨酸来源的天然色素，兼具着色与保健功能，市场需求因合成染料禁令而快速增长。本研究在拟南芥、烟草和大豆三种底盘植物中稳定表达优化后的甜菜红素合成通路，通过“推-拉”策略平衡前体供给与下游转化。结果显示，大豆对工程通路具有更高的代谢耐受性，强启动子驱动的“推+拉”株系在果荚和种子中均积累高水平的甜菜红素，为天然色素可持续生产提供了新底盘。
研究背景
甜菜红素是酪氨酸衍生的特化代谢物，呈黄色或红色，在植物中仅由石竹目成员天然产生。除鲜艳色泽外，甜菜红素还表现出抗癌、抗炎或抗糖尿病等潜在健康益处。由于在宽pH范围内具有高稳定性，甜菜红素被广泛用作天然食品着色剂。截至2024年，全球食品染料市场超过40亿美元，且主要由石油衍生的合成染料主导。然而，日益增长的健康与环境担忧正加速向更安全、可持续的天然替代品转变。2025年1月，美国FDA禁止在食品和口服药物中使用合成染料Red No. 3，欧洲和加州已实施类似限制。2025年4月，FDA宣布即将出台法规，逐步淘汰美国食品工业中包括Red No. 40在内的更多合成染料。尽管需求不断增长，天然甜菜红素的价格远高于合成染料，主要原因是目前甜菜等天然来源的产量有限。大多数植物合成生物学研究以本氏烟草为主要代谢底盘，因其农杆菌浸润方法快速，但其他植物物种的代谢潜力尚未充分开发。
研究方法
初始“推/拉”构建体的设计：为验证“推-拉”策略是否能在异源植物宿主中提高甜菜红素产量（图1a），生成了4个初始构建体，分别表达：（i）空载体（EV）；（ii）通过过表达BvTyrAα增强酪氨酸产生（“推”）；（iii）3个甜菜红素基因（“拉”）；（iv）BvTyrAα和3个甜菜红素基因（“推/拉”）。由于甜菜红素通路中的代谢瓶颈尚未确定，初始设计使用组成型启动子，可不调整单个基因的表达水平而实现连续表达。
图1 优化的甜菜红素构建体通过额外酪氨酸供给提升本氏烟草叶片中的甜菜红素产量。a）甜菜红素色素的简化生物合成通路。来自甜菜的arogenate脱氢酶（BvTyrAα）对酪氨酸的反馈抑制表现松弛，本研究利用该酶“推动”酪氨酸供给。甜菜红素生物合成通路用于“拉动”增强的酪氨酸供给以生产甜菜红素。细胞色素P450 CYP76AD1催化第一步反应，将酪氨酸转化为L-DODA，随后由L-DOPA 4,5-双加氧酶（DODA）催化形成甜菜醛氨酸，或由CYP76AD1催化形成环-DOPA（cDOPA）。cDOPA 5-O-葡萄糖基转移酶（cDOPA5GT）将cDOPA糖基化生成cDOPA 5-O-葡萄糖苷。星号表示形成甜菜花青素的自发反应。b）“推”“拉”和“推+拉”构建体的示意图。使用拟南芥光收获叶绿素-蛋白复合物II亚基B1启动子（PAtLHB1B1）或拟南芥NADH脱氢酶泛醌1β亚复合物亚基启动子（PCL1）和胭脂碱合酶终止子（NosT）表达BvTyrAα编码序列，其N端侧翼为矮牵牛叶绿体转运肽（CTP），C端为YFP标签。在BvTyrAα编码序列中插入马铃薯ST-LS1基因的第二内含子序列，以防止“推”构建体在原核生物中的边际表达；番茄rubisco启动子（PSlRbcS2）和本氏烟草Actin3终止子（NbActT）用于表达RUBYv2。拟南芥rubisco启动子（PAtRbcS3）和无内含子烟草延伸蛋白终止子（EU）与热激蛋白终止子（EU/HSPT）组合用于表达BvDODA编码序列，其C端侧翼为FLAG标签。c）农杆菌介导的构建体在本氏烟草叶片中的瞬时表达。照片在浸润后3天（dpi）拍摄。d）浸润叶片中酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素水平的定量。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用4个生物学重复。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。EV，空载体。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
稳定转化尝试：烟草和大豆最初用于稳定转化，因为在组织培养早期阶段（如愈伤组织和芽再生，或新生的分生组织组织和早期芽）可通过视觉检测甜菜红素色素沉着。EV、推和拉构建体成功生成了转基因T0烟草株系；然而，推/拉构建体未获得稳定转基因株系。同样，在大豆中，虽然EV、推和拉构建体生成了多个稳定T0株系，但未获得推/拉株系。测序确认二元载体构建体内没有重组或错误。鉴于在烟草和大豆中的一致失败，这些构建体未在拟南芥中测试。
失败原因探究：为调查失败的根本原因，这些构建体在本氏烟草中瞬时表达并开展系列实验。“推/拉”构建体显示从L-DOPA到甜菜红素的转化有限，导致L-DOPA过度积累。当RUBY“拉”构建体与“推”和额外拷贝的DODA基因共表达时，实现了最高的甜菜红素产量。这些结果表明，“推”和“拉”工程之间的不平衡导致过量的L-DOPA和/或其衍生物，可能干扰了稳定转基因株系的成功生成。
新甜菜红素构建体的设计：为进一步缓解DODA酶催化的瓶颈步骤，设计了新的RUBYv2构建体，重新排列甜菜红素生物合成基因，将DODA置于其他2个甜菜红素基因的上游（图1b）。该设计利用了多顺反子表达系统中第一个基因较高的翻译效率和表达水平。此外，新“拉”构建体包含一个额外的DODA转录单元（图1b）。为防止两个相同序列之间可能的重组，使用了具有与RUBY构建体中密码子优化的BvDODA不同DNA序列的甜菜BvDODA转录单元，编码相同的BvDODA蛋白。
内含子插入与启动子选择：在新“推”和“推+拉”构建体的BvTyrAα编码序列中插入了含有框内提前终止密码子的马铃薯ST-LS1内含子序列。这是为了仅允许功能性BvTyrAα在植物内表达，因为先前的工作表明农杆菌中BvTyrAα转基因的泄漏表达可能损害细菌活力和转化效率。此外，BvTyrAα在2种不同启动子下表达，以找到“推”效应的最佳水平。使用拟南芥光收获叶绿素-蛋白复合物II亚基B1启动子（PAtLHB1B1，AT2G34430）以高水平表达BvTyrAα（“PAtLHB1B1-push”），并与新“拉”构建体在同一光合组织中表达，其中2个rubisco启动子（即PAtRbcS3和PSlRbcS2）用于表达RUBYv2和BvDODA。还使用来自拟南芥NADH脱氢酶泛醌1β亚复合物亚基的弱组成型PCL1启动子（AT1G76200）表达BvTyrAα（“PCL1-push”）。据此，生成了2个新“推+拉”构建体（即“PAtLHB1B1-push + pull”和“PCL1-push + pull”），每个构建体表达BvTyrAα、RUBYv2和额外的BvDODA（图1b）。
瞬时表达验证：新构建体的功能首先通过在本氏烟草叶片中瞬时表达进行测试。表达EV、PAtLHB1B1-push或PCL1-push构建体的叶片中未观察到可见色素沉着。相反，在pull、PAtLHB1B1-push + pull或PCL1-push + pull表达叶片中观察到强烈色素沉着（图1c）。浸润斑点于浸润后3天收获，使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行代谢物分析。酪氨酸水平在PAtLHB1B1-push表达叶片中最高，其次是PCL1-push，反映了这2种启动子之间的表达水平差异（图1d）。推+拉表达叶片的酪氨酸水平略低于或显著低于其相应的仅推株系，表明酪氨酸被用于下游甜菜红素生产（图1d）。这些推+拉表达叶片中的L-DOPA水平远低于表达先前构建体的叶片。
研究结果
烟草T0株系的表型与代谢物分析：在烟草中，表达推、拉或推+拉构建体的稳定T0植株在从生根培养基移植到土壤后6周表现出不同表型（图2a）。使用PAtLHB1B1（强组成型）或PCL1（弱组成型）启动子的推构建体均导致植株生长受限。拉构建体植株生长相对正常。推+拉构建体部分缓解了仅在推株系中观察到的生长惩罚。对成熟叶片的代谢物分析显示（图2b），PAtLHB1B1-push株系的酪氨酸水平最高，PCL1-push株系次之。拉株系的酪氨酸水平与EV对照相当。推+拉株系的酪氨酸水平介于仅推和仅拉株系之间。L-DOPA水平在所有株系中均较低。甜菜花青素含量在拉和推+拉株系中显著高于EV和仅推株系。PAtLHB1B1-push + pull株系的甜菜花青素含量最高，其次是PCL1-push + pull株系。
图2 推+拉构建体部分缓解T0烟草推株系中观察到的生长惩罚。a）表达推、拉或推+拉构建体的稳定T0烟草植株在从生根培养基移植到土壤后6周的表型。推构建体使用PAtLHB1B1（强组成型）或PCL1（弱组成型）启动子。b）稳定烟草转基因T0株系成熟叶片中酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素水平的定量。从生根培养基移植到土壤后6周收集叶盘进行代谢物分析。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用生物学重复进行，样本量如下：EV（n = 4）、PCL1-push（n = 3）、PAtLHB1B1-push（n = 5）、pull（n = 32）、PCL1-push + pull（n = 34）和PAtLHB1B1-push + pull（n = 28）。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。EV，空载体。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
大豆T0株系的表型与代谢物分析：大豆T0转基因株系表现出对酪氨酸和L-DOPA的耐受性高于烟草转基因株系（图3a）。表达推、拉或推+拉构建体的稳定T0大豆株系在组织培养后均能正常生长。PAtLHB1B1-push + pull株系在叶片中表现出最强的甜菜红素色素沉着，叶片呈深红色。代谢物分析显示（图3b），PAtLHB1B1-push株系的酪氨酸水平最高。推+拉株系的酪氨酸水平低于相应的仅推株系。L-DOPA水平在所有株系中均较低。甜菜花青素含量在拉和推+拉株系中显著高于EV和仅推株系。
图3 大豆T0转基因株系对酪氨酸和L-DOPA的耐受性高于烟草转基因株系。a）表达推、拉或推+拉构建体的稳定T0大豆株系的表型；阴性对照为组织培养来源的非转化株系。b）大豆T0稳定转基因株系成熟叶片中酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素的定量。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用生物学重复进行，样本量如下：Wm82（n = 4）、PCL1-push（n = 15）、PAtLHB1B1-push（n = 14）、pull（n = 15）、PCL1-push + pull（n = 16）和PAtLHB1B1-push + pull（n = 22）。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。Wm82，Williams 82。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
烟草T1株系的遗传稳定性：甜菜红素色素在烟草T1株系中可遗传（图4a）。表达EV、拉或推+拉构建体的稳定T1烟草株系在发芽后3个月表现出不同的表型。推+拉株系仍表现出一定的生长受限，但叶片中的甜菜红素色素沉着明显。拉株系的花色正常，而PCL1-push + pull株系的花表现出粉红色色素沉着（图4b）。代谢物分析显示（图4c），推+拉T1株系的甜菜花青素含量显著高于拉株系。部分推+拉株系（如2497-1-11和2497-2-12）的甜菜花青素含量最高，表明该性状在T1代稳定遗传。
图4 甜菜红素色素在烟草T1株系中可遗传。a）表达EV、拉或推+拉构建体的稳定T1烟草株系在发芽后3个月的表型。EV，空载体。b）EV、拉或PCL1-push + pull构建体的稳定T1烟草株系的花的表型。c）烟草稳定转基因T1株系成熟叶片中酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素水平的定量。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用生物学重复进行，样本量如下：EV（n = 6）、2497-1-11（n = 12）、2497-2-12（n = 8）、2497-2-6（n = 12）、2524-2-5（n = 8）、2524-2-16（n = 3）、2524-3-2（n = 5）、2524-3-5（n = 9）、2521-2-4（n = 6）和2521-3-8（n = 11）。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
大豆T1种子中的代谢物积累：PCL1-push + pull T1大豆种子显示游离和蛋白结合酪氨酸水平升高（图5a）。T1大豆种子的表型分析显示，推+拉株系的种子呈深红色，而EV种子颜色正常。代谢物分析显示（图5b），PCL1-push + pull和PAtLHB1B1-push + pull株系种子中的游离酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素水平均显著高于EV。蛋白结合氨基酸水平分析显示（图5c），推+拉株系种子中蛋白结合酪氨酸水平升高，表明增强的酪氨酸供给不仅用于甜菜红素合成，还整合到种子储存蛋白中。
图5 PCL1-push + pull T1大豆种子显示游离和蛋白结合酪氨酸水平升高。a）来自EV、PCL1-push + pull和PAtLHB1B1-push + pull株系的T1大豆种子表型，分别显示带种皮和不带种皮。b）转基因大豆T1种子中游离酪氨酸、L-DOPA、甜菜花青素和苯丙氨酸水平的定量。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用6个生物学重复进行。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。c）大豆转基因T1种子中蛋白结合氨基酸水平的定量。实验使用6个生物学重复进行。字母表示基于单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
大豆T1株系的叶片色素沉着：PAtLHB1B1-push + pull株系的叶片表现出最强的甜菜红素色素沉着，同时完成T1代的整个生命周期（图6a）。拉株系叶片呈浅红色，而推+拉株系叶片呈深红色。代谢物分析显示（图6b），PAtLHB1B1-push + pull株系（2693-17a和2693-7a）的甜菜花青素含量最高，其次是PCL1-push + pull株系。所有推+拉株系的酪氨酸水平均高于拉株系。L-DOPA水平在所有株系中均较低。
图6 PAtLHB1B1-push + pull株系的叶片表现出最强的甜菜红素色素沉着，同时完成T1代的整个生命周期。a）拉或推+拉构建体的稳定T1大豆株系以及野生型Williams 82（Wm82）的表型。b）大豆稳定转基因T1株系成熟叶片中酪氨酸、L-DOPA和甜菜花青素水平的定量。酪氨酸和L-DOPA水平通过LC-MS分析。总甜菜花青素含量使用分光光度计在538 nm处测量吸光度。实验使用生物学重复进行，样本量如下：EV（n = 5）、2693-17a（n = 9）、2693-7a（n = 5）、2689-21a（n = 2）、2691-16a（n = 5）、2691-2a（n = 6）、2691-5a（n = 5）和2691-7a（n = 5）。字母表示基于log10转换值单因素方差分析后Tukey HSD检验的显著差异（P < 0.05）。箱线图在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
跨物种比较：跨物种比较甜菜红素产量揭示了物种和/或启动子依赖的代谢耐受性和生命周期结果（图7）。三种不同物种（即拟南芥、烟草和大豆）被测试稳定表达优化的甜菜红素通路，结合额外的DODA和RUBYv2（“拉”）以及通过BvTyrAα增强酪氨酸前体供给（“推”），在PAtLHB1B1或PCL1启动子下表达。
图7 跨物种比较甜菜红素产量揭示物种和/或启动子依赖的代谢耐受性和生命周期结果。三种不同物种（即拟南芥、烟草和大豆）被测试稳定表达优化的甜菜红素通路。拟南芥、烟草和大豆图像在BioRender中生成（https://www.biorender.com）。
讨论与解读
甜菜红素是酪氨酸来源的色素，在植物中仅由石竹目产生，因其在宽pH范围内的稳定性而被视为天然食品着色剂。环境和监管压力正加速从合成染料向天然替代品的转变。然而，甜菜根作为商业甜菜红素生产的主要来源，受季节限制且成本高昂。早期茄科稳定转基因工作产生了中等水平的色素，茄子、马铃薯中为0.065至0.12 mg/g鲜重，番茄汁中高达0.25 mg/mL。多顺反子RUBY系统简化了通路组装，并将甜菜红素生产扩展到胡萝卜（0.94 mg/g干重）和本氏烟草（约1.03 mg/g鲜重）。进一步推动前体供给和解除DODA步骤瓶颈，将本氏烟草甜菜花青素产量提升至2.87 mg/g鲜重，超过典型水平。
本研究通过精心设计“推+拉”策略，在三种不同植物底盘（拟南芥、烟草和大豆）中实现了甜菜红素的高效稳定生产。大豆表现出对工程通路更高的代谢耐受性，强启动子驱动的推+拉株系在叶片和种子中均积累了高水平的甜菜红素，且未出现严重生长缺陷。这归因于大豆更强的氨基酸代谢缓冲能力，使得额外的酪氨酸供给能够被有效整合到蛋白质合成和甜菜红素生产中。
编译者解读：本研究的方法论亮点在于系统性的底盘比较——同一套“推-拉”构建体在三种植物中产生截然不同的表型结果，这提示合成生物学中底盘选择的重要性不亚于通路设计本身。大豆种子的高蛋白背景为酪氨酸衍生物的积累提供了天然缓冲池，这一发现为今后在富含储存蛋白的作物中生产氨基酸衍生色素提供了新思路。局限在于，研究未深入解析大豆耐受性的分子机制，且产量尚未达到工业化规模。未来若能将此策略与高生物量能源作物结合，或可进一步释放植物合成生物学的应用潜力。
参考来源
Jung S, de Oliveira MVV, Collier R, Yobi A, Angelovici R. Chassis selection and metabolic fine-tuning enable efficient in planta betalain production. Plant Physiol. PMID: 42261105.
PMID: 42261105