黄曲霉毒素与杂色曲霉素在五种坚果中的UHPLC-MS/MS定量分析

来源：Mycotoxin Res | 编译：DNA Lab Space

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导读

坚果营养丰富，却易被产毒真菌污染。本研究以黄曲霉（Aspergillus flavus）接种五种坚果，利用UHPLC-MS/MS结合稳定同位素稀释分析，系统比较了黄曲霉毒素B1、B2及杂色曲霉素在不同坚果基质中的生成差异。结果发现毒素产量高度依赖菌株，而核桃是黄曲霉毒素合成的最适基质——部分菌株在核桃上产生的AFB1超过11,000 µg/kg，远超其他坚果。该发现为坚果真菌毒素风险评估提供了关键数据。

研究背景

坚果富含蛋白质、必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，是全球消费者饮食中营养密度最高的食物类别之一。虽然从植物学角度，腰果仁、开心果和花生并不属于真正意义上的坚果，但日常语境中"坚果"一词被广泛使用，本文统一采用这一集合术语指代所有研究基质，即腰果、榛子、花生、核桃和开心果。

坚果在德国市场的重要性持续上升：2018年德国树坚果种植面积仅600公顷，2024年已增至1,600公顷；2024/25年度坚果和干果消费量达48.2万吨；2024年德国坚果市场销售额约30.4亿欧元，预计2030年将升至近39亿欧元。

树坚果易被多种真菌定殖，导致变质并产生有毒次级代谢产物。其中，产毒曲霉属（Aspergillus）物种尤为令人担忧，因其可产生具有肝毒性的黄曲霉毒素（AFs）。本研究选取五种市售坚果，在受控条件下接种不同黄曲霉菌株，系统考察毒素生成差异。

研究方法

化学试剂

LC-MS级乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）；LC-MS级超纯水由Th. Geyer（德国雷宁根）提供。氯化钠（NaCl）购自Avantor（原VWR Darmstadt，德国）；无水硫酸镁（MgSO₄）、甲酸（FA）、氨水（NH₄OH）和甲酸铵溶液（NH₄HCO₂）购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆），纯度均为分析级或更高。分散固相萃取（dSPE）净化管为Supel™ QuE PSA（伯胺/仲胺）/C18管，含400 mg Discovery™ DSC-18、1200 mg无水MgSO₄和400 mg Supelclean™ PSA，购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）。Oxoid™林格氏液片剂购自Thermo Fisher Scientific（德国达姆施塔特），Tween® 80购自Sigma-Aldrich Canada Co（加拿大安大略），麦芽提取琼脂购自Millipore（加拿大安大略），乙醇购自Honeywell Riedel-de Haën（德国塞尔策）。

样品

去壳但未经其他处理的核桃、腰果、榛子、花生和开心果样品购自德国市场，在室温避光条件下储存至进一步处理。

分析标准品

含AFG1、AFG2、AFB1和AFB2（各1 µg/mL）的乙腈混合黄曲霉毒素溶液及未标记杂色曲霉素（STC）购自Romer Labs（原Biopure，奥地利图尔恩）。标记标准品[¹³C₁₇]AFG1、[¹³C₁₇]AFG2、[¹³C₁₇]AFB1、[¹³C₁₇]AFB2和[¹³C₁₈]STC由Fianovis（原Libios，法国文德里叙尔蒂尔迪讷）提供。

储备液配制

将购得的标记和未标记毒素储备液用乙腈进一步稀释，获得0.1、0.01和0.001 µg/mL的工作浓度。所有溶液于-28 °C储存。

黄曲霉菌株

为涵盖菌株间差异，选取五株黄曲霉，其产毒潜力各不相同或未表征，分别为DSM 1959、NRRL 3357、AF 70、CBS 119.62和NRRL 1957，选择依据为机构可获得性。所有黄曲霉菌株在慕尼黑工业大学微生物学教研室麦芽提取琼脂上培养。

黄曲霉接种

孢子悬浮液制备

黄曲霉菌株在麦芽提取琼脂上培养以获得孢子，用无菌林格-吐温溶液（25%（w/v）林格氏液水溶液，0.1%吐温（v/v））收获孢子。孢子悬浮液浓度通过将系列稀释液涂布于麦芽提取琼脂并计数菌落来确定。随后用林格-吐温溶液将孢子悬浮液稀释至约1×10⁵孢子/mL，并通过重新涂布和菌落计数验证。孢子悬浮液的制备方法改编自弗劳恩霍夫过程工程与包装研究所（IVV）的方案。

表面消毒

表面消毒使用95%乙醇，参照Amini等（2016）的方法。坚果仁浸入乙醇/水溶液（95:5，v/v）中，在层流罩（BDK，德国索嫩比尔-根金根）内室温干燥过夜。随后将坚果置于带DURAN®含膜盖（孔径=0.2 μm）的无菌实验室烧瓶中。表面消毒效果在预实验中评估：取10 g核桃，用5 mL林格-吐温溶液剥离微生物组，随后涂布于麦芽提取琼脂。预实验证实95%乙醇可成功对核桃仁进行表面消毒。选择该表面消毒方法是为了尽量减小对样品材料的改变——其他方式（如高压灭菌）可能带来热变化，影响真菌生长和黄曲霉毒素生成潜力。

接种设两个生物学重复。核桃样品接种所有不同黄曲霉菌株；腰果、榛子、花生和开心果样品仅接种AF 70和CBS 119.62菌株。对照样品用无菌林格-吐温溶液代替孢子悬浮液处理。接种条件参照Assunção等（2015）所述方案：30 °C、95%相对湿度下培养20天，设生物学重复。100 g表面消毒后的坚果仁与相当于仁质量2%（w/w）的孢子悬浮液混合，然后在气候箱（Climacell EVO，MMM Group，德国慕尼黑）中按指定条件培养。

孢子灭活

孢子灭活基于黄曲霉孢子的热敏感性（Zhang等，2018）。接种实验结束后，样品立即在55 °C干燥90 min，以实现完全孢子灭活。

每个样品随后用实验室粉碎机（Grindomix GM 200，Retsch GmbH，德国哈恩）粉碎，于-28 °C储存至进一步样品制备（图4）。

水分含量

样品水分含量通过红外干燥法测定，使用水分分析仪（Kern & SOHN GmbH，德国巴林根-弗罗默恩）。取2.5 g匀化样品，在120 °C下干燥至恒重，根据记录的质量损失计算水分含量。

真菌毒素提取

所有样品（未处理坚果、表面消毒坚果、对照和接种坚果）的样品制备均按照Schneidemann-Bostelmann等（2026）的方案进行，设三次重复。所有细节汇总于补充信息（补充表1）。

方法验证

所用方法已根据Vogelgesang和Hädrich（1998）的方案完成验证（Schneidemann-Bostelmann等，2026），验证结果汇总于补充信息（补充表2）。

校准与定量

所有分析物通过稳定同位素稀释分析（SIDA）定量。校准曲线通过将固定量的稳定同位素标记标准品（IS）与不同浓度的相应未标记分析物（A）组合制备，摩尔比n(A)/n(IS)介于0.01至100之间（1:100、1:50、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1）。将色谱峰面积比[A(A)/A(IS)]对相应摩尔比[n(A)/n(IS)]作图构建校准函数。采用线性回归获得响应曲线，线性通过Mandel拟合检验验证（Mandel，1964）。

UHPLC-MS/MS分析

UHPLC-MS/MS测量以Dick等（2024）和Schneidemann-Bostelmann等（2026）先前描述的方法为基础。但本研究中所有非AFs和STC的分析物均从方法中移除，因其与本研研究无关。色谱分离使用Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统（Shimadzu，日本京都）。采用Waters BEH C18 UHPLC色谱柱（Acquity BEH C18，100 mm，1.7 μm × 2.1 mm；Waters GmbH，德国埃施博恩），柱温40 °C。流动相流速设为0.3 mL/min。二元梯度由溶剂A（5 mM甲酸铵水溶液，用25% NH₄OH溶液调至pH 9）和溶剂B（甲醇）组成。梯度程序：5% B保持2 min，1 min内升至18% B；随后2 min内逐步升至25% B；之后8 min内升至90% B，0.5 min内进一步升至99% B，保持2 min；随后3.5 min内返回5% B，再平衡5 min。进样体积原文未详述。

研究结果

不同坚果类型中检出的真菌毒素水平综合数据（包括AFB1、AFB2和STC）见图5和图6。精确浓度列于补充信息（补充表4–7）。对照及接种AF70和CBS 119.62菌株的坚果图像见补充信息（补充图1–22）。

不同菌株接种后核桃中黄曲霉和STC的产生

对接种不同黄曲霉菌株的核桃中AFs和STC的定量分析显示，AFB1、AFB2和STC的产生具有强烈的菌株依赖性，而所有样品均未检出AFG1和AFG2。这一观察与黄曲霉已知的生物合成能力高度一致——黄曲霉产生B型黄曲霉毒素和STC，但不产生G型黄曲霉毒素（Ráduly等，2020）。因此可以认为接种成功，且未发生与其他曲霉属物种的交叉污染。未处理的核桃未检出AFs或STC，表面消毒样品亦未检出。两个对照样品中有一个检出低水平AFB1（0.18 ± 0.09 µg/kg），且该样品可见真菌污染。虽然菌丝体的表型外观类似于曲霉属，但未进行分类学确认。鉴于核桃产自德国——在该生态条件下产毒黄曲霉或寄生曲霉的自然污染在生态学上极不可能——且消毒方案已在预实验中验证，该单一事件最可能代表二次实验室污染，而非原料的基线定殖。

逐一考察各黄曲霉菌株可以发现，几乎所有菌株都能产生AFB1。此处AFB1浓度的增加特指初始未接种基质的基线水平与培养后检出水平之间的差异。在α = 0.05显著性水平下，接种AF70菌株的样品（1494 ± 180 µg/kg和>11,000 µg/kg）、接种CBS119.62菌株的样品（0.30 ± 0.02 µg/kg和23.4 ± 4.95 µg/kg）、接种NRRL 1957菌株的样品（0.18 ± 0.09 µg/kg和0.95 ± 0.02 µg/kg）以及接种NRRL 3357菌株的样品（569 ± 82.6 µg/kg和151 ± 1.31 µg/kg）中AFB1浓度显著增加。仅DSM 1959菌株未能在核桃上产生AFB1。AFB2和STC仅由AF70（AFB2：147 ± 13.6 µg/kg和1,411 ± 298 µg/kg；STC：60.2 ± 2.17 µg/kg和262 ± 36.1 µg/kg）、NRRL 3357（AFB2：76.8 ± 3.92 µg/kg和9.51 ± 0.86 µg/kg；STC：4.00 ± 0.06 µg/kg和1.29 ± 0.20 µg/kg）以及CBS 119.62的一个生物学重复（AFB2：3.58 ± 0.38 µg/kg；STC：0.26 ± 0.04 µg/kg）在显著水平上产生。然而，由于NRRL 3357菌株的菌丝生长明显强于AF70和CBS 119.62，我们决定使用AF70和CBS 119.62接种其他坚果品种。这一选择主要出于安全考虑——尽量减少后续样品匀化过程中的粉尘形成和潜在孢子气溶胶化，从而降低生物安全风险。生物学重复之间观察到的差异可能由潜在的热点效应解释：如果重复中某一颗坚果的毒素浓度高于其他坚果，接种后匀化可能导致样品总AF水平升高。

AF70和CBS 119.62菌株接种后核桃、榛子、腰果、开心果和花生中AF和STC的产生

与核桃中的观察一致，腰果、开心果、榛子和花生中仅检出B型AFs和STC，未检出G型AFs，表明黄曲霉接种成功且无交叉污染。未处理的榛子和腰果不含AFB1、AFB2和STC，而开心果原料含有AFB1（0.76 ± 0.11 µg/kg）、AFB2（0.35 ± 0.06 µg/kg）和STC（0.22 ± 0.01 µg/kg）。花生原料受STC污染（0.25 ± 0.01 µg/kg）。

考察用于接种不同坚果基质的两个菌株可以发现，AF70菌株能在除开心果外的所有坚果上产生AFB1，且与各自起始原料相比，AFB1浓度在α = 0.05显著性水平下显著增加（腰果：0.11 ± 0.01 µg/kg和0.16 ± 0.02 µg/kg；榛子：0.11 ± 0.01 µg/kg和3.56 ± 0.90 µg/kg；花生：0.16 ± 0.05 µg/kg和17.9 ± 8.27 µg/kg）。接种AF70菌株导致腰果中AFB2浓度增加（两个样品均在LOD和LOQ之间）、花生中AFB2浓度增加（5.43 ± 0.94 µg/kg和6.54 ± 1.19 µg/kg），以及一个接种榛子生物学重复中AFB2浓度增加（0.18 ± 0.02 µg/kg）；STC生成仅在一个花生生物学重复（5.28 ± 0.18 µg/kg）和一个榛子生物学重复（0.08 ± 0.02 µg/kg）中观察到。在开心果上，该黄曲霉菌株未产生任何AFs或STC。与核桃上的毒素生成相比，该菌株在核桃上产生的AFB1、AFB2和STC浓度明显高于其他受检坚果。

CBS119.62菌株仅能在一个花生生物学重复中产生AFB1（0.06 ± 0.01 µg/kg），并在花生中产生AFB2（7.59 ± 1.13 µg/kg和0.26 ± 0.04 µg/kg）以及在一个榛子生物学重复中产生AFB2（0.13 ± 0.03 µg/kg）。与在核桃上的行为相反，该菌株未在任何其他受检坚果上产生STC。黄曲霉菌株CBS 119.62无法在开心果上产生AFs或STC。如核桃所述，其他坚果也应考虑热点效应的可能性，因为单颗受污染坚果可导致个别样品中AF水平升高。

不同坚果基质上AF和STC生成的比较及文献数据

比较不同坚果基质上的AF生成可以发现，受试黄曲霉菌株在核桃上产生的B型AFs和STC浓度显著高于其他坚果。这与Molyneux等（2007）的发现形成对比——该研究报道核桃因没食子酸和其他抗氧化化合物而具有抑制AF的特性。但他们也指出，这些化合物必须存在于种皮（外种皮）而非胚乳中，因为不含种皮的籽仁材料未表现出抑制活性。

据作者所知，这是首个在完整、未破损坚果基质中系统比较AF生成的研究，因此无法与相同实验设计的文献进行直接比较。为评估不同坚果类型间AF模式差异背后的生物学合理性，讨论借鉴了关于关键基质特性的既有文献。此外，已发表的市售和储存坚果中AF自然发生数据被用作现实基准，以验证某些坚果中观察到的高易感性和其他坚果中的较低蓄积是否与历史监测数据一致。

讨论与解读

对接种黄曲霉后不同坚果基质中AFB1、AFB2和STC的定量分析揭示了这些曲霉毒素生成的显著菌株依赖性。受试菌株在产AFs和STC能力上差异显著，而核桃始终支持比其他四种坚果明显更高的AF生成。这些发现表明，在本研究的实验条件下，核桃是黄曲霉毒素合成的特别有利基质。这种增强易感性的机制尚不清楚，可能与核桃特有的基质特性有关，如核桃独特的脂肪酸组成、营养可利用性、种皮完整性及其相关抗菌化合物。观察到的基质特异性差异证明，坚果类型可强烈影响黄曲霉的产毒潜力。

虽然核桃目前受AF污染的频率低于开心果或花生，但文献数据显示某些情况下核桃可出现极高AF水平，如摩洛哥核桃中检出高达2,500 µg/kg（Juan等，2008）。这支持了本研究结果——尽管核桃中AF目前尚不令人担忧，但在未来气候变化的背景下，核桃蓄积高浓度AF的潜力可能成为欧洲未来的健康关切。

编译者解读

本研究的方法学亮点在于采用稳定同位素稀释分析（SIDA）结合UHPLC-MS/MS，实现了五种坚果基质中三种毒素的精确定量，校准范围覆盖0.01至100的摩尔比，动态范围宽达四个数量级，为处理高度异质的食品基质提供了可靠范式。从合成生物学视角看，该研究揭示的"菌株-基质"互作特异性提示：风险评估不应仅关注菌株产毒基因型，还需将基质代谢物组纳入考量。核桃中AFB1高达11,000 µg/kg的现象值得警惕，建议后续研究深入解析核桃脂肪酸或酚类化合物对黄曲霉次级代谢通路的分子调控机制。

参考来源

Schneidemann-Bostelmann S, Nöth F, Asam S, Rychlik M. Quantification of aflatoxins and sterigmatocystin in walnuts, cashews, pistachios, peanuts, and hazelnuts by using UHPLC-MS/MS following Aspergillus flavus inoculation. Mycotoxin Res. PMID: 42550348. DOI: 10.1007/s12550-026-00666-w.

PMID: 42550348