来源：Microb Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
混合连接β-葡聚糖（MLG）是一类结构独特的生物聚合物，在生物技术领域展现出可观的应用潜力。然而，其生物合成机制的全貌尚未阐明，高效生产的策略也仍有待开发。近日，西班牙科学家在《Microbial Biotechnology》发表论文，揭示了外膜蛋白TolC是苜蓿中华根瘤菌合成MLG的必要组件，并证实通过共表达tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶，可在生物反应器条件下实现约10 g/L的MLG产量，较对照提升8倍。
研究背景
混合连接β-葡聚糖是一类由葡萄糖单元通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的多糖，广泛存在于谷物细胞壁中，在食品、医药和材料科学领域具有重要价值。在根瘤菌中，MLG的生物合成受第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控，并由双顺反子操纵子bgsBA介导。此前研究已鉴定出BgsA作为糖基转移酶催化多糖链延伸，BgsB则可能参与聚合物的转运或锚定。然而，完整的生物合成机器组成仍不清楚，特别是聚合物如何跨越外膜完成分泌这一关键环节，一直悬而未决。
已有研究表明，在多种革兰氏阴性菌中，外膜蛋白TolC常与内膜转运蛋白形成三组分复合物，介导底物跨膜外排。TolC是否也参与MLG的合成或分泌，此前未见报道。本研究正是基于这一线索展开探索。
研究方法
菌株与培养条件
研究使用了苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）8530、日本中生根瘤菌（Mesorhizobium japonicum）和菜豆根瘤菌（Rhizobium etli）等菌株。常规培养采用添加3.40 mM CaCl₂·2H₂O的胰蛋白胨-酵母提取物培养基（TY），或最小培养基（MM）。MM培养基成分为（每升）：10 g甘露醇、1.1 g谷氨酸钠、0.3 g KH₂PO₄、0.3 g K₂HPO₄、0.15 g MgSO₄·7H₂O、0.05 g CaCl₂·2H₂O、0.006 g FeCl₃和0.05 g NaCl，另添加1 mL 1000×维生素储备液（含0.2 g/L生物素、0.1 g/L盐酸硫胺素和0.1 g/L泛酸钠）。
S. meliloti和M. japonicum菌株在28°C下培养，R. etli菌株在30°C下培养。用于克隆和接合转移的大肠杆菌在37°C的LB培养基中培养。抗生素使用浓度：四环素（Tc）10 μg/mL（R. etli为5 μg/mL）、卡那霉素（Km）50 μg/mL、刚果红（CR）50 μg/mL、荧光增白剂（CF）200 μg/mL、IPTG 1 mM。所有质粒通过大肠杆菌β2163或S17.1供体菌株接合转移导入根瘤菌。
三突变体构建
为探究其他c-di-GMP调控的胞外多糖对MLG产量的影响，研究者构建了同时缺失EPS II、EPS I和APS三种多糖合成的三突变体。通过框内删除wgcA（EPS II）、exoY（EPS I）和uxs1-uxe（APS）三个基因实现。突变依次引入，并通过PCR和表型分析双重验证——PCR确认基因缺失，表型分析确认相应多糖合成表型的消失。构建完成的三突变体命名为IBR606。
MLG摇瓶生产与定量
MLG定量采用地衣多糖酶（lichenase）消化后测定葡萄糖当量的方法。根瘤菌在含100 mL厄伦迈耶烧瓶的20 mL液体MM培养基中培养，添加适当浓度四环素。S. meliloti菌株在28°C、R. etli菌株在30°C下，170 rpm振荡培养3天。初始OD₆₀₀调至0.05。
生物反应器条件
原文摘要提及生物反应器条件下MLG产量可达约10 g/L，但全文关键段未详述反应器的具体参数（如罐体体积、搅拌转速、通气量、pH控制策略等）。
研究结果
TolC对MLG合成不可或缺
遗传破坏tolC基因完全消除了S. meliloti的MLG合成能力，而回补（complementation）该基因则恢复了MLG产量。这一结果明确证明TolC是MLG生物合成的必需组分。研究者据此提出，TolC与BgsA和BgsB共同构成三组分复合体，协同完成聚合物的合成和/或外排。这一发现填补了MLG生物合成机制中关于聚合物跨外膜转运的关键空白。
三突变体IBR606的MLG产量
在生理c-di-GMP水平下，野生型S. meliloti 8530的MLG产量低于检测限。三突变体IBR606（ΔwgcA ΔexoY Δuxs1-uxe）的MLG产量相对野生型无显著提高。当携带质粒pJBpleD（通过表达组成型活性二鸟苷酸环化酶提高胞内c-di-GMP水平）时，IBR606的MLG产量被显著提升，略高于野生型携带同一质粒的水平，但差异未达到统计学显著。该结果表明，S. meliloti*合成其他c-di-GMP调控的胞外多糖（EPS I、EPS II和APS）的能力对MLG产量无重大影响。
共过表达实现8倍增产
将tolC、bgsBA和组成型活性二鸟苷酸环化酶基因pleD***共过表达，所得MLG产量较携带对照质粒（不含tolC*）的菌株提高了8倍。在生物反应器条件下，产量可达约10 g/L。这一数据表明，TolC不仅是MLG合成的必需因子，更是产量提升的限速环节之一——补足TolC的表达量，才能释放MLG合成的全部潜力。
跨宿主可移植性
该遗传模块（tolC + bgsBA + pleD）还被成功应用于非MLG生产菌株——日本中生根瘤菌（M. japonicum*），实现了MLG的从头合成（de novo production）。这证明该模块具有良好的可移植性，能够实现细菌底盘（chassis）的交换，为合成生物学应用提供了灵活的宿主选择空间。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于鉴定出TolC为MLG生物合成机器的关键组件。三组分复合体模型的提出，将MLG合成机制从内膜扩展到了外膜，完善了聚合物从合成到分泌的完整图景。从应用角度看，8倍增产和约10 g/L的产量数据，使MLG的规模化生产迈出了实质性一步。
该研究选择共表达tolC而非仅优化bgsBA表达量，这一策略背后的逻辑值得玩味——它暗示在天然菌株中，TolC的供应量可能本就构成MLG合成的瓶颈。此外，模块在异源宿主M. japonicum中的成功表达，说明该套系统不依赖特定菌株的背景基因，这为未来在不同工业微生物底盘中进行MLG生产开辟了道路。
不过，原文摘要未详述生物反应器的具体运行参数，也未提供三组分复合体的结构或生化互作证据。TolC与BgsA/BgsB之间如何发生物理互作、聚合物如何穿越周质空间、c-di-GMP如何在分子水平激活整个系统——这些问题仍有待后续研究解答。
参考来源
Ruiz-Sáez L, Pacheco PJ, Peinado J, Lloret J, Muñoz S. TolC Is Required for a Mixed-Linkage β-Glucan (MLG) Biosynthesis: Engineering Bacteria for MLG Overproduction. Microbial Biotechnology. PMID: 42552791.
PMID: 42552791