来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为一种环境友好型生物催化剂，在工业废水处理领域备受关注。本研究采用三步相分配法（TPP）从嗜热地衣芽孢杆菌SO8中纯化漆酶，实现5.65倍纯化和102.07%回收率。该酶分子量约38.7 kDa，最适pH 9.0、最适温度70°C，在宽泛pH和温度范围内保持稳定，并展现出对多种染料的脱色潜力。研究为工业漆酶的低成本纯化提供了新方案。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧气氧化还原酶，EC 1.10.3.2）是一种含四个铜离子的多酚氧化酶。在将氧气还原为水的过程中，这类酶催化单酚、二酚、多酚、芳香族化合物、有机污染物及无机底物的氧化。凭借对多种酚类和非酚类化合物的氧化能力，漆酶成为纺织、造纸木质素降解、污染物解毒、葡萄酒澄清、有机化学合成、生物传感器及酶生物燃料电池阴极反应等领域的重要工业酶。
漆酶结构中含有约15–40%的碳水化合物（如葡萄糖、甘露糖、己糖胺和阿拉伯糖），这些糖基赋予酶高稳定性。漆酶单体的分子量一般在50–85 kDa范围内。与真菌和植物来源的漆酶相比，细菌漆酶具有更宽的底物特异性、快速且成本低廉的生产方式、更宽的最适pH范围、增强的热稳定性和碱性耐受性等优势。尽管细菌漆酶多样性的基因组知识不断扩展，对其具体特性的研究仍然有限。
研究方法
菌株与化学试剂
本研究使用Olmez等人从内夫谢希尔Kozaklı温泉分离的地衣芽孢杆菌SO8菌株（GenBank编号：MG076978）作为漆酶来源。所用化学试剂和溶剂均购自Merck（德国）和Sigma-Aldrich（美国）。
酶活与蛋白测定
漆酶活性采用改良自Wang等人（2014）的方法测定。简要流程如下：0.5 mL酶溶液与1 mL含0.5 mM ABTS的100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）在55°C下孵育15 min。对照组以缓冲液代替酶溶液。酶活性通过在420 nm波长下分光光度法监测ABTS的氧化来确定。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 µmol ABTS所需的酶量。活性计算按照Baltierra Trejo等人（2015）描述的公式进行。蛋白质浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品（Bradford 1976）。
漆酶的纯化
培养液中的细菌细胞与漆酶一起通过离心（6000 rpm，15 min，4°C）去除。获得的匀浆用作TPP的酶源。在漆酶纯化中，首先为达到最高纯化效率，对硫酸铵浓度（20–80% w/v）、匀浆/叔丁醇比例（1.0:0.5，1.0:1.0，1.0:1.5，1.0:2.0 v/v）和pH（2.0–11.0）等参数进行TPP纯化优化。TPP过程中，首先将不同浓度的硫酸铵加入2 mL匀浆中并缓慢涡旋，然后按不同比例加入叔丁醇并涡旋30 s。混合物在室温下孵育1 h，随后6000 rpm离心5 min。离心后观察到三相形成，去除上层叔丁醇，立即将中间相和下层水相分别收集到不同试管中。对中间相和下层水相进行漆酶活性和总蛋白浓度分析。中间相的蛋白质沉淀用0.1 M pH 7.0磷酸钠缓冲液溶解。确定硫酸铵和叔丁醇比例后，将匀浆（2 mL）用70%硫酸铵饱和，并用1 M NaOH和1 M HCl调节至不同pH（pH 2.0–11.0），然后加入叔丁醇。按下层和中间相的漆酶活性和蛋白质含量按上述方法测定。绘制代表活性回收率（%）相对于纯化倍数的图表。
SDS-PAGE分析
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析确定TPP法部分纯化漆酶的纯度和分子量。电泳过程使用12%（w/v）分离胶和4%（w/v）浓缩胶，基于Laemmli（1970）方法。每孔上样20微升。凝胶运行过程先在250 V下运行5–10 min以确保浓缩阶段，然后在120 V下约90 min使蛋白质在分离胶中分离。蛋白条带通过银染20 min显色。蛋白质分子量标记物（ECOTECH）用作标准品。
纯化漆酶的表征
pH和温度的影响
为确定纯化漆酶的最适pH，在0.1 M缓冲液（pH 2至12）中评估酶活性。所用缓冲液包括甘氨酸-HCl（pH 2.0–3.0）、醋酸钠（pH 4.0–5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0–7.0）、Tris-HCl（pH 8.0–9.0）和甘氨酸-NaOH（pH 10.0–11.0）。为确定纯化漆酶的最适温度，在20至90°C温度范围内进行酶活性测量。显示最高活性的pH和温度值被视为100%用于相对活性计算。为评估pH稳定性，将0.5 mL漆酶在不同pH值的缓冲液中孵育2 h。随后测量残留活性，初始活性设为100%。热稳定性通过将酶在20°C至90°C温度范围内孵育30、60、90和120 min来评估。在最适pH（pH 5.0）下使用1.5 mL缓冲液、1 mL底物和0.5 mL酶溶液测定残留活性。初始活性被视为100%用于相对活性计算。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
为研究某些金属离子对漆酶的影响，使用20 mM（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）金属离子溶液，将0.5 mL纯化漆酶加入每种金属离子中使终浓度为1、5和10 mM，孵育30 min，然后测定剩余漆酶活性。对照组的酶活性（不含任何金属盐）视为100%。类似地，研究不同表面活性剂和抑制剂对漆酶的影响：Triton X-100、Tween-20、Tween-80浓度分别为1%、5%和10%，SDS浓度为5、10和20 mM，以及NaF和EDTA。孵育结束后，以初始活性为100%测定漆酶的残留活性。
底物特异性
使用各种酚类（愈创木酚、单宁酸和L-酪氨酸）和非酚类（ABTS）底物确定从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的底物特异性。ABTS底物溶液用100 mM磷酸盐缓冲液（pH 6）制备，愈创木酚和单宁酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液制备，L-酪氨酸用50 mM Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液制备。漆酶活性最高的底物的活性被视为100，计算其他底物的相对活性（%）。
酶动力学
为确定从地衣芽孢杆菌SO8纯化的漆酶的动力学参数，测量ABTS底物在50–1000 µM范围内不同浓度下的活性。用所得值绘制Lineweaver-Burk图，利用该图计算Km、Vmax、Kcat和催化活性（Kcat/Km）。
染料脱色
反应混合物由0.5 mL染料溶液、0.5 mL漆酶和1 mL 0.5 mM ABTS介体溶液组成。该混合物在55°C下分别孵育15、30、60和120 min，每次孵育在不同初始pH值（5.0、7.0和9.0）下进行。孵育结束时的剩余染料浓度在最适波长下用分光光度法分析。染料脱色百分比按以下公式计算：脱色率（%）= [(Ci−Ct)/Ci] × 100。其中Ci为染料初始浓度，Ct为剩余染料浓度。
统计分析
所有涉及从地衣芽孢杆菌SO8分离的漆酶的实验均进行三次重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示，代表三次独立实验的平均值和变异性。漆酶表征数据的统计分析使用GraphPad Prism®软件（版本9.0，GraphPad Software，San Diego，CA）进行Student双尾t检验。
研究结果
酶的分离与纯化
为获得耐受极端条件的漆酶，选择本实验室前期分离鉴定的耐热菌株中活性最高的地衣芽孢杆菌SO8细菌。TPP作为一种简单、快速、一步式的生物分离技术，被用于从细菌液体培养物中纯化漆酶，以替代昂贵、耗时且多步骤的传统方法。首先，为以最高产率通过TPP法纯化从地衣芽孢杆菌SO8菌株分离的漆酶，对叔丁醇、硫酸铵、pH和比例等参数进行了优化。优化纯化条件对于实现高酶纯度和产率至关重要。图1展示了各参数对匀浆中漆酶纯化系数和产率的影响。
最优条件确定为70%（w/v）硫酸铵浓度、1.0:1.0匀浆液：叔丁醇比例和pH 9.0，实现5.65倍纯化和102.07%产率（图1）。表1总结了使用TPP纯化SO8漆酶的总体流程。在优化条件下，TPP有效从地衣芽孢杆菌SO8粗提物中纯化漆酶，实现102.07%的产率和5.65倍纯化。叔丁醇浓度的增加导致有机相吸水量增加，提高水相盐度，从而促进蛋白质在界面沉淀。漆酶在TPP过程中通常分配至界面相。产率超过100%是TPP方法在纯化过程中去除抑制剂并激活酶的能力所致。此外，TPP过程中使用的硫酸铵和叔丁醇的联合效应可引起酶三维构象的积极变化，使其转变为更活跃的结构。
先前研究已证明TPP适用于漆酶的高产率纯化。例如，一项研究报告了平菇漆酶的27.8倍纯化和161%产率。Rajeeva和Lele（2011）通过两阶段TPP实现了灵芝属漆酶60%的产率和13.1倍纯度。Liu等人报道了通过TPP纯化漆酶获得20倍纯度和约75%产率。与其他常用方法相比——如硫酸铵沉淀-固定化金属亲和色谱法对平菇漆酶（46倍纯化，57.4%产率）、超滤法对灵芝属漆酶（3.7倍纯化，90.4%产率）以及超滤法对焦皮菌属漆酶（2.14倍纯化，87%产率）——TPP通常展现出更优越的纯化产率。TPP是一种新兴的蛋白质沉淀生物分离技术，能够实现高效酶纯化和回收。与传统色谱方法相比，TPP在蛋白酶和淀粉酶等酶的纯化中显示出获得更高纯度的潜力。TPP因其多功能性而日益受到认可，现广泛用于各工业领域的蛋白质回收。
表1 从B. licheniformis SO8纯化漆酶的纯化表
| 纯化步骤 | 总活性 (EU/mL) | 总蛋白 (mg/mL) | 比活性 (EU/mg) | 回收率 % | 纯化倍数 |
|---------|---------------|----------------|---------------|----------|---------|
| 粗提物 | 72.446 | 0.520 | 139.32 | 100 | 1 |
| TPP-界面相 | 73.948 | 0.094 | 786.68 | 102.07 | 5.65 |
| TPP-水相 | 31.08 | 0.256 | 121.4 | 42.9 | 0.87 |
表2 部分表面活性剂和抑制剂的影响
| 处理 | 浓度 | 残留活性 (%) |
|------|------|-------------|
| 对照 | - | 100 |
| 表面活性剂 (% v/v) | | |
| Triton X-100 | 1 | 82.26 ± 2.65 |
| | 5 | 41.72 ± 5.85 |
| | 10 | 19.92 ± 0.489 |
| Tween-20 | 1 | 100.3 ± 1.495 |
| | 5 | 98.39 ± 7.159 |
| | 10 | 40.79 ± 0.233 |
| Tween-80 | 1 | 119.9 ± 18.875 |
| | 5 | 103.2 ± 11.361 |
| | 10 | 41.72 ± 3.527 |
| 抑制剂 (mM) | | |
| SDS | 5 | 100.8 ± 3.604 |
| | 10 | 92.83 ± 4.404 |
| | 20 | 58.97 ± 8.414 |
| NaF | 5 | 90.54 ± 3.871 |
| | 10 | 79.93 ± 0.998 |
| | 20 | 60.61 ± 8.159 |
| EDTA | 5 | 114.1 ± 13.401 |
| | 10 | 82.97 ± 1.710 |
| | 20 | 49.65 ± 1.456 |
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析证实了TPP对漆酶纯化的有效性（图2）。与粗酶提取物（泳道a）和水相（泳道b）相比，仅在界面相（泳道c）观察到单一蛋白条带。这一观察强烈表明TPP有效去除了污染蛋白和其他分子，使界面相富集目标漆酶。根据SDS-PAGE分析，纯化的地衣芽孢杆菌SO8漆酶的分子量约为38.7 kDa。
该分子量落在其他细菌物种漆酶报道的范围内，如B. tequilensis SN4漆酶32 kDa、屎肠球菌A2漆酶50.11 kDa和Arthrobacter gonensis P39漆酶160 kDa。
pH和温度对酶活性和稳定性的影响
从地衣芽孢杆菌SO8菌株纯化的漆酶的最适pH确定为9.0，表明其为碱性酶（图3A）。发现漆酶在宽pH范围（pH 2.0–11.0）内保持超过50%的活性（图3B）。观察到从SO8菌株分离的漆酶在高pH值下保持稳定，在所有pH值下120 min结束时仍保留超过35%的活性。在高pH值下表现活性并保持稳定的漆酶在工业上需求很高。虽然在60 min时观察到相对活性下降，但120 min时相对活性的恢复和增加表明酶对极端条件的抗性，代表初始环境胁迫后的结构恢复和激活过程。来自链霉菌和Thioalkalivibrio的耐碱漆酶大多源自芽孢杆菌属物种。
为确定地衣芽孢杆菌SO8漆酶酶的温度曲线和稳定性，在20°C至90°C的温度范围内进行研究，结果显示其在70°C时表现出最大活性，在20–90°C范围内保持高活性（图3C）。漆酶酶的活性测量在20°C至90°C温度范围内进行，持续120 min，按周期性间隔取样。观察到漆酶在所有研究温度下2 h孵育期间显著保留其活性（图3D）。漆酶的高耐热性是其进化适应的结果，这得益于其含有的密集碳水化合物基团、强二级结构键，尤其是其细菌起源。在这些温度范围内长时间不失活很重要，因为纺织工厂的废水可能处于高温状态。冷却水既需要时间又需要资源。先前研究已证明来自不同来源的漆酶存在显著的热不稳定性。例如，Koschorreck等人（2008）报道真菌漆酶在70°C下2 h后活性丧失92%，而Halaburgi等人（2011）观察到C. cladosporioides漆酶在80°C下5 min内活性丧失52%。相比之下，地衣芽孢杆菌SO8漆酶表现出卓越的热稳定性。这种显著的稳定性表明其对高温具有高耐受性和宽操作温度范围。
金属离子、抑制剂和表面活性剂的影响
研究了各种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）对地衣芽孢杆菌SO8漆酶活性的影响。在1和5 mM浓度的Fe²⁺和Mn²⁺离子存在下，漆酶酶的活性增加。在其他金属离子存在下，酶活性受到不同程度的影响。
底物特异性
漆酶对ABTS表现出最高的底物特异性，其他底物的相对活性均以ABTS为基准计算。
酶动力学
通过Lineweaver-Burk图（图5）确定了漆酶对ABTS底物的动力学参数。Km为110 µM，Vmax为19.6 µmol L⁻¹ min⁻¹，kcat为0.048 s⁻¹，kcat/Km为0.44 s⁻¹ mM⁻¹。
染料脱色
染料脱色实验表明，在120 min孵育期间，六种不同染料在pH 5、pH 7和pH 9条件下的脱色效果不同（图6）。对酸性红27的脱色效率最高，达到38%。
讨论与解读
本研究成功采用三步相分配法（TPP）从地衣芽孢杆菌SO8中一步纯化漆酶。TPP被证明是一种快速、经济且高效的替代方案，实现5.65倍纯化和102%产率。纯化的漆酶在宽pH范围（2.0–11.0）和温度范围（20–90°C）内表现出显著稳定性。值得注意的是，它在高温下保留了92%的活性，超过了文献中报道的许多细菌漆酶的热稳定性。此外，该酶对多种金属离子（Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、K⁺、Zn²⁺）、化学物质/抑制剂（NaF和EDTA）和表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-80）表现出显著耐受性。这种稳健的稳定性，加上其广泛的活性谱和脱色潜力，使地衣芽孢杆菌SO8漆酶成为多种工业应用（特别是生物修复）的有前景候选者。
编译者解读
本研究的关键亮点在于TPP纯化策略的巧妙运用——单步操作即实现5.65倍纯化且回收率超过100%，这得益于TPP同时去除抑制物并激活酶构象的双重效应。从合成生物学应用视角看，该酶突出的碱性和热稳定性（pH 9.0、70°C最优）恰好匹配纺织废水的高温高碱特征。然而，38%的染料脱色率仍偏低，后续若通过定向进化或理性设计提升其氧化还原电位，或结合介体系统优化，有望释放该酶在工业废水处理中的更大潜力。
参考来源
Yıldırgan S, Aygün E, Altintas R, Şişecioğlu M. Purification of laccase from thermophilic Bacillus licheniformis SO8 with three-phase partitioning, characterization, and usage in dye decolorization. 3 Biotech. PMID: 42179929.
PMID: 42179929