来源：3 Biotech | 编译：DNA Lab Space
导读
抗生素滥用引发的环境耐药性问题日益严峻。本研究从土耳其卡奇卡尔山溪水样中分离到一株耐冷假单胞菌R11S16，从中克隆了一个YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因，在大肠杆菌中实现异源表达，获得分子量仅约23 kDa的小型冷活性酯酶PsEstyfh。该酶在20 °C和pH 9下活性最高，耐盐、耐多种有机溶剂，能降解大环内酯类抗生素阿奇霉素的抗菌活性，且降解产物对浮萍无显著毒性。这是首次报道来自P. sivasensis的重组酯解酶的功能表征与生物技术潜力。
研究背景
抗生素在人类治疗、动物饲养及食品保藏中的失控使用，已导致全球范围内抗菌药物耐药性（AMR）快速上升，成为公共卫生的重大威胁。耐药感染不仅限制治疗选择，还通过增加发病率、死亡率和住院时间给医疗系统带来沉重经济负担。据估计，仅美国每年就有超过35,000人死于耐药感染；若趋势持续，到2050年全球因抗生素耐药导致的年死亡人数可能超过1,000万。AMR造成的全球经济年损失据报超过1,000亿美元。
释放到自然环境中的抗生素即使在低浓度下也会产生选择压力，加速耐药基因的发育和传播，从而在环境抗生素污染与抗生素耐药性之间建立了直接联系。尽管许多国家已实施限制抗生素使用的国家行动计划，但人口增长、兽药和工业化畜牧业的持续使用，使得抗生素残留不断进入环境，增加了人群中耐药微生物的出现频率。在此背景下，开发能够降解环境抗生素残留的生物催化剂具有现实需求。酯酶因其底物谱广、反应条件温和，在环境修复中具有应用潜力。本研究聚焦于一株耐冷假单胞菌来源的新型小型酯酶，探索其酶学特性及去除阿奇霉素污染的能力。
研究方法
材料与试剂
克隆所用的酶、缓冲液及无核酸酶水购自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)。甘油、牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝R-250、β-巯基乙醇（βME）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸、正磷酸、有机溶剂及对硝基苯酚（p-NP）连接的底物购自Sigma-Aldrich (Darmstadt, Germany)。培养基和缓冲液组分购自Merck (Darmstadt, Germany)。乙二胺四乙酸（EDTA）购自PanReac Applichem (Barcelona, Spain)。其他试剂和实验室设备（玻璃/塑料器皿）除非另有说明，分别购自Tekkim (Bursa, Turkey)、Biobasic (Toronto, Canada)、AnalytiChem (Zedelgem, Belgium)和Condalab (Madrid, Spain)。
菌株的分子鉴定
一株耐冷菌株R11S16分离自卡奇卡尔山脉采集的水样（GPS坐标：40°52′54.01″ N，41°08′23.26″ E）。以R2A琼脂为分离培养基，通过反复划线接种于营养琼脂上纯化分离株R11S16。使用PureLink® DNA分离试剂盒（Invitrogen, USA）按制造商说明书从过夜培养物中提取基因组DNA。用通用细菌引物（27F和1525R）通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR产物经纯化后，使用ABI PRISM 3730 XL自动测序仪，以正向引物518F和反向引物800R进行测序。
ABI格式的色谱文件用Chromas 1.45版检查，拼接引物重叠区获得分离株R11S16的16S rRNA基因核苷酸序列（FASTA格式）。所得16S rRNA基因序列提交至GenBank，登录号为PP213417。将该序列上传至EzBioCloud服务器，确定最近邻系统发育物种的成对序列相似性。使用MEGA X软件包，以邻接法（neighbor-joining）、最大简约法（MP）和最大似然法（ML）构建系统发育树。树拓扑结构通过1000次bootstrap重采样评估。由于本研究的主要焦点是冷活性酯酶的功能表征，未进行基因组水平的分类学分析。
YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因的克隆
基于Pseudomonas sivasensis模式菌株基因组数据设计引物，引物两端含XhoI酶切位点（斜体）。用NEB cutter v3.0检查基因的限制性酶识别位点，用SignalP-6.0网络工具分析可能的信号肽。用Thermo Fisher Scientific Multiple Primer Analyzer评估引物内部及彼此之间形成二聚体的可能性。使用NEB Tm Calculator网络工具计算熔解温度，同时考虑PCR反应中使用的DNA聚合酶。
将P. sivasensis R11S16过夜新鲜培养物以10,000 × g离心10分钟收集细胞，用Invitrogen™ PureLink™基因组DNA Mini Kit按制造商指南提取基因组DNA。使用正向引物（5′-ATTCTCGAGCTGTATATCCACGGTTTC-3′）和反向引物（5′-AATCTCGAGCAGTGCCGAAAAATC-3′）扩增YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因。扩增反应在热循环仪微量管中进行，反应体系含：10X Taq缓冲液（3 µL）、Taq DNA聚合酶（0.25 µL，1.25 U）、基因组DNA（3 µL）、10 µmol正向引物（0.8 µL）、10 µmol反向引物（0.8 µL）、10 mM dNTP（0.8 µL）和无核酸酶水（18.95 µL）。反应混合物在热循环仪（Biorad-T100™, Hercules, CA）中先95 °C预变性2分钟，然后进行30个循环：95 °C变性40秒，60 °C退火40秒，72 °C延伸60秒，最后72 °C终延伸5分钟。使用FavorPrep™质粒提取试剂盒（Favorgen, Pintung, Taiwan）从E. coli DH5α细胞中提取质粒pET20b(+)。PCR产物和pET20b(+)分别用XhoI（# ER0691）按制造商指南进行酶切。酶切产物从0.8%琼脂糖凝胶中用GeneJET凝胶提取试剂盒回收后，取6 µL PCR产物和2 µL线性化pET20b(+)进行连接，连接反应体系含1 µL 10X T4 DNA连接酶缓冲液、0.5 µL 5 U/µL T4 DNA连接酶（# 15224041）和0.5 µL无核酸酶水，25 °C过夜。取连接混合物（3.5 µL）通过热激转化法导入CaCl₂-感受态E. coli DH5α细胞（50 µL）。转化子在含终浓度50 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长，随后对转化子重复提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，通过比较长度鉴定含重组分子的克隆。验证后的重组分子用相同转化方法亚克隆至E. coli BL21(DE3)中进行异源表达。
异源表达与纯化
将含重组分子的克隆环接种至250 mL锥形瓶中的50 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，37 °C、175 rpm振荡培养至OD₆₀₀达到0.4–0.6。然后向培养物中加入IPTG至终浓度0.3 mM，继续在18 °C、175 rpm条件下振荡培养5小时。培养结束后，10,000 × g离心5分钟，收集上清液作为粗酶液。表达情况通过SDS-PAGE和酯酶活性测定验证。
粗酶液通过10-kDa分子量截断（MWCO）再生纤维素超滤膜（Ultracell®, Merck Millipore, MA, USA）在Amicon™-搅拌超滤池（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）中浓缩。将等体积的浓缩粗酶液与HisPur™ Ni-NTA树脂（Thermo Scientific™）轻轻混合，4 °C保持1小时。未结合蛋白用磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.4）洗脱通过柱体，结合蛋白用含100–400 mM咪唑线性梯度的洗涤缓冲液以0.3 mL/min流速洗脱。收集具有酯酶活性的级分（每份1 mL），合并、浓缩，并对50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）透析，用于后续研究。
SDS-PAGE分析、总蛋白定量与酯酶活性测定
SDS-PAGE分析采用Laemmli（1970）方法的改良版，在10%丙烯酰胺凝胶上进行。电泳使用Mini-Protean Tetra Cell电泳系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA），蛋白条带经考马斯亮蓝染色后用Gel Doc XR系统（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）成像。酶溶液的总蛋白浓度用Bradford（1976）方法，以牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行定量。酯酶活性通过在410 nm波长下分光光度法监测对硝基苯酚（p-NP）的释放来测定。
研究结果
菌株R11S16的系统发育归属
获得了菌株R11S16近乎完整的16S rRNA基因序列（1459 bp）。比较序列分析显示，菌株R11S16与Pseudomonas sivasensis P7ᵀ的序列相似性为100.0%，其次为Pseudomonas petroselini MAFF 311,094ᵀ（99.93%）和Pseudomonas extremaustralis 14-3ᵀ（99.86%）。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析将菌株R11S16归入假单胞菌属，与P. sivasensis P7ᵀ紧密聚簇。可比的树拓扑结构表明菌株R11S16具有稳定且一致的系统发育位置。尽管若干密切相关的假单胞菌物种表现出高的16S rRNA基因序列相似性，菌株R11S16在所有系统发育重建中始终与P. sivasensis谱系的模式菌株聚为一组，并具有强的bootstrap支持。菌株R11S16在胰蛋白大豆琼脂（TSA）上形成光滑、圆形、奶油色菌落，与假单胞菌属成员常见的表型特征一致。值得注意的是，分析中包含的若干系统发育相关物种此前已从寒冷或温带环境中报道过，支持菌株R11S16作为耐冷细菌和冷活性酶潜在来源的生态相关性。基于16S rRNA基因序列相似性和与模式菌株的系统发育聚类，菌株R11S16被归属于P. sivasensis。该分子鉴定水平被认为足以为后续聚焦于菌株R11S16产生的冷活性酯酶的生化表征和工业潜力分析提供可靠的分类框架。
克隆、异源表达与纯化
从P. sivasensis R11S16分离株基因组DNA中PCR扩增的YqiA/YcfP家族α/β折叠水解酶基因（yfh）经电泳分析，在0.8%琼脂糖上观察到约600碱基的单一条带，与预期一致。扩增的yfh基因和pET20b(+)成功经XhoI酶切、连接，所得构建体（pET20b(+)-yfh）转化至E. coli DH5α。在氨苄青霉素存在下37 °C过夜生长的转化子，通过比较快速分离质粒的大小筛选为携带pET20b(+)-yfh。重组分子中的插入片段用通用T7启动子（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和T7终止子（5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）引物测序鉴定。由此验证了重组分子及基因方向。此外，将克隆基因与模式菌株P. sivasensis中的同源基因用Clustal Omega比对，并在Jalview中可视化。据此，分离株R11S16的yfh基因中第108、254、256、257、275和297位核苷酸与P. sivasensis模式菌株不同。基于NCBI数据库的蛋白质分析结果表明，该基因产物的氨基酸序列与来自P. sivasensis（蛋白质登录号：WP_181640331.1）、Pseudomonas cyclaminis（WP_122305492.1）、Pseudomonas fluorescens（WP_191946927.1）、Pseudomonas grimontii（WP_090400878.1）、Pseudomonas rhodesiae（WP_348749120.1）和Pseudomonas azotoformans（WP_071497189.1）的YqiA/YcfP家族α/β水解酶分别有97.0%、96.5%、95.5%、95.5%、95.0%、94.5%和94.0%的差异。最后，验证后的重组分子被亚克隆至E. coli BL21(DE3)中。
yfh基因在T7启动子控制下带组氨酸标签（6X-His）进行胞外表达。基因表达通过SDS-PAGE分析评估。在丙烯酰胺凝胶上，与含和不含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液相比，在含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)细胞培养物胞外液中观察到分子量约23 kDa的独特蛋白条带，证明了yfh基因的表达。此外，从含pET20b(+)-yfh的E. coli BL21(DE3)经IPTG诱导培养物中回收的粗酶液的酯酶效价为56.83 ± 0.82 U/mL。相比之下，在相同条件下生长的含pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)培养物中未检测到胞外酯酶活性。表达的重组蛋白被命名为PsEstyfh。PsEstyfh的比活性为170.10 ± 5.09 U/mg蛋白。SDS-PAGE分析还显示，该酶的分子量低于来自Pseudomonas sp. TB11、Serratia sp.、Zunongwangia profunda、Bacillus halodurans、Pseudomonas sp. E2-15、Deinococcus radiodurans、Pseudomonas sp. E5-12、Aphanizomenon flos-aquae、Arthrobacter soli、Halobacterium salinarum、Haloarcula japonica和Aspergillus niger的冷活性酯酶。另一方面，其分子量与来自Psychrobacter pacificensis、Bacillus cohnii和Lysinibacillus sp.的冷活性酯酶相似。总之，PsEstyfh可能是迄今报道的最小的冷活性酯解酶。PsEstyfh的小型化特性使其值得用于与其他冷活性酶（尤其是漆酶）构建融合蛋白，以应用于生物修复。
PsEstyfh的生物信息学分析
Protparam分析确认表达酶的分子量约为23,024.75 Da。分析显示该酶等电点为6.11，在大肠杆菌中的半衰期超过10小时。PsEstyfh的不稳定指数计算为37.26，表明……
温度对PsEstyfh活性的影响
PsEstyfh的稳定性特征
NaCl对PsEstyfh酯解活性的影响
金属离子和化学试剂对PsEstyfh催化活性的影响
有机溶剂对PsEstyfh活性的影响
PsEstyfh的底物特异性与动力学参数
以p-NPB为底物，从Lineweaver-Burk图确定PsEstyfh的米氏常数（Kₘ）为129.97 µM，最大反应速度（Vₘₐₓ）为33.3 µmol/min。酶的底物偏好顺序为C4 > C8 > C2 > C10。
PsEstyfh与底物的分子对接分析
PsEstyfh对阿奇霉素抗菌活性的去除
生态毒理学评估
讨论与解读
本研究报道了一种来自P. sivasensis R11S16的此前未被表征的酯解酶，并成功在大肠杆菌中表达。该酶具有多种理想的生化特征组合：低温下强活性、碱性pH偏好、宽pH范围内良好的稳定性、对多种添加剂（NaCl、有机溶剂、金属离子和化学试剂）的适度耐受性，以及紧凑的分子结构。这些特性使其特别适用于废水处理应用。此外，该酶几乎完全消除阿奇霉素的抗菌活性，且过程中释放的转化产物未产生毒性效应，凸显了PsEstyfh作为大环内酯类抗生素生物催化去除和减少环境耐药性传播的有前景工具。除环境应用外，该酶还适用于洗涤剂、纺织和制药行业。另外，酶的小分子尺寸为合成生物学应用提供了显著优势，特别是在设计多功能融合酶以扩展催化多功能性、去除结构多样的外源化合物方面。
编译者解读
PsEstyfh的突出之处在于"小"——约23 kDa的分子量使其成为迄今报道的最小冷活性酯酶之一，这为融合蛋白设计提供了理想的模块化构建单元。酶在20 °C和pH 9下表现最佳，兼有耐盐和耐溶剂特性，契合工业废水处理的实际场景。对阿奇霉素抗菌活性的高效去除及降解产物的低生态毒性，展示了酶法治理大环内酯类抗生素残留的可行性。不过，本研究以16S rRNA基因鉴定菌种，未进行基因组水平的分类确认，且实际废水基质中的降解效率仍有待验证。未来若能与漆酶等构建融合酶，或可实现对多种抗生素复合污染的协同降解。
参考来源
Çon G, Karakaya E, Saygin H, Saricaoğlu S, Könen Adıgüzel S. Heterologous expression of a cold-active small esterolytic enzyme from Pseudomonas sivasensis R11S16 and its potential for azithromycin removal. 3 Biotech. PMID: 42245393. DOI: 10.1007/s13205-026-04884-y.
PMID: 42245393